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Newsletter 4

L’arbre, la fleur et le fruit : suite

Nous poursuivons dans ce numéro de la Newsletter la publication d’aperçus de travaux de quelques équipes louvanistes engagées dans un effort de recherche clinique, de transfert ou fondamentale.

Il y a 54 ans, Francis Crick et James Watson découvraient la structure en double hélice de la molécule d’ADN, constituant des gènes, support de l’hérédité. La structure de l’ADN élucidée a ouvert la voie à la compréhension du fonctionnement des cellules et permis d’identifier les gènes favorisant la multiplication anarchique des cellules cancéreuses.

À ce propos, en 1985, David J. Weatherall écrivait : « nous vivons une période extraordinaire en matière de développement des sciences biologiques. Au fur et à mesure de l’application des techniques de biologie cellulaire et moléculaire à la recherche médicale, la plupart des énigmes de la pathologie humaine seront résolues dans les toutes prochaines années … Heureux les jeunes praticiens qui vont en être les acteurs ! ».(1)

En cancérologie, aujourd’hui, ces progrès anticipés sont bien au rendez-vous. Dans la première issue de la Newsletter, notre article « l’ère des molécules intelligentes » résumait comment ces avancées ont conduit au développement rationnel de thérapeutiques ciblées et spécifiques de la cellule cancéreuse. Mais le progrès engrangé ne s’arrête pas là. La moisson de connaissances nouvelles a également des applications diagnostiques et pronostiques bien illustrées par les travaux des équipes louvanistes qui font l’objet de cette livraison.

L’article de L. Knoops est une bonne introduction à l’important travail de l’équipe de S. Constantinescu et explique clairement le rôle des cytokines, de leurs récepteurs et de la machinerie d’aval de transmission du signal dans la cancérogenèse.

Les syndromes myéloprolifératifs sont caractérisés par l’indépendance ou l’hypersensibilité des progéniteurs hématopoïétiques malins à de nombreuses cytokines. À l’instar du modèle princeps de la leucémie myéloïde chronique, il était suspecté qu’une activité tyrosine kinase constitutive était à l’origine des autres syndromes myéloprolifératifs. L’article de M. Girardot et S. Constantinescu montre brillamment comment l’identification de mutations de JAK 2, une tyrosine kinase cytoplasmique, donne un début d’explication à la cancérogenèse des syndromes myéloprolifératifs Bcr-Abl négatifs et mène d’une part au diagnostic et à une classification moléculaire de ces entités et identifie d’autre part de nouvelles cibles pour le développement de traitements spécifiques.

En anatomopathologie, et particulièrement en ce qui concerne les tumeurs du système nerveux central, le diagnostic est trop souvent d’une extrême difficulté. Et pourtant, les traitements se diversifiant, l’enjeu thérapeutique associé au diagnostic est devenu important. L’élégant travail de C. Godfraind et M. Vikkula dans ce domaine témoigne des progrès accomplis grâce à la génétique moléculaire.

La définition de facteurs prédictifs par les techniques de biologie moléculaire constitue une nouvelle avenue de recherche en cancérologie. La mise au point, l’amélioration et l’exploitation d’un tel test dans le cancer de la vessie (détection de mutations et caractérisation fonctionnelle de p53) sont rapportées avec un enthousiasme contagieux par A-F. Dekairelle et coll. 

Enfin, l’article de O. Feron rappelle qu’au-delà du dérèglement de certains gènes de la cellule cancéreuse, il faut concevoir la cancérogenèse en prenant également en compte l’environnement de la tumeur et particulièrement la néovascularisation, authentique perversion d’un processus physiologique normal, dont la correction a valeur thérapeutique.

Nous vous avions annoncé une interview du Professeur Thierry Boon. Ses travaux en immunologie et génétique du cancer lui ont ouvert les portes d’une assemblée prestigieuse : la National Academy of Sciences des Etats-Unis. Vous lirez avec intérêt son opinion sur l’avenir en Belgique de la recherche en cancérologie.
Après ces deux issues de la newsletter consacrées à la recherche en nos murs et cette lecture un peu aride de sujets qui nous sont moins familiers,nous reviendrons dans le prochain numéro à un domaine de grande actualité clinique : le cancer du sein.

(1). Weatherall D : The New Genetics and Clinical Practice. Oxforf University Press,1985

Interview du Professeur Thierry Boon par l’équipe scientifique de la Fondation contre le Cancer, D.Vander Steichel, MD et P.Servais, PhD.

L’Avenir de la recherche en cancérologie
Le point de vue d’un éminent chercheur belge

Thierry Boon Falleur est professeur à la Faculté de médecine de l’UCL et directeur de l’Institut Ludwig pour la Recherche sur le Cancer à Bruxelles. Il a également siégé pendant de nombreuses années au sein du Conseil scientifique de la Fondation contre le Cancer. 
Il vient de voir sa carrière en immunothérapie anticancéreuse saluée par une prestigieuse reconnaissance mondiale. En effet, en mai dernier, il a été nommé membre effectif d’un des cercles scientifiques les plus réputés au monde : la National Academy of Sciences des États-Unis. 

Aujourd’hui, cet homme passionnant n’a pas hésité à nous accorder une interview.


Prépondérance du financement privé
Comment voyez-vous l’avenir du financement de la recherche cancérologique dans notre pays ? Et quel est le rôle de la Fondation à ce niveau ?
On dit souvent que la Belgique ne finance pas suffisamment la recherche. C’est vrai, mais il faut également reconnaître que nos chercheurs ont, jusqu’à présent, judicieusement utilisé les montants qui leur ont été octroyés. Pourquoi ? Parce que la Belgique bénéficie d’une véritable tradition d’autonomie universitaire : les universités et la recherche n’ont jamais été scindées. Grâce à cela, nous avons pu éviter le phénomène de bureaucratisation qui a sclérosé la recherche dans d’autres pays ! 

D’autre part, le soutien financier de la recherche s’est accru ces dernières années, grâce notamment à certaines mesures fiscales prises par le gouvernement, sous l’impulsion du ministre des Finances Didier Reynders. Elles se sont révélées être un véritable « ballon d’oxygène » pour les instituts de recherche et les universités !

Mais la situation est encore loin d’être idéale et le financement privé conserve une place incontestable dans le soutien de la recherche. A cet égard, la Fondation contre le Cancer joue un rôle crucial. Par ailleurs, les fonds octroyés par la Fondation ne sont pas liés à un excès de paperasserie. La qualité des travaux de recherche menés dans nos universités s’en trouve ainsi améliorée. Nous ne pouvons que nous en féliciter !
 
Pressions et bas salaires n’épargnent pas nos chercheurs
Nous constatons qu’il y a de moins en moins de médecins et de plus en plus de docteurs en sciences impliqués dans la recherche médicale. Est-ce une tendance à encourager ? 
Avant d’aborder ce point, il faut bien comprendre quel est le profil du chercheur en recherche fondamentale. C’est un individu qui pose lui-même les questions scientifiques et qui élabore diverses stratégies pour tenter d’y répondre. Ce chercheur doit donc bénéficier d’une réelle liberté d’action et de pensée, ce qui nécessite également une grande disponibilité !

Il y a une trentaine d’années, on travaillait avec des équipes composées de médecins et de non-médecins. Ces personnes avaient du talent et se consacraient entièrement à leurs travaux de recherche. Aujourd’hui, il est beaucoup plus difficile de recruter des jeunes médecins, à cause notamment du numerus clausus ! Par ailleurs, certaines procédures trop rigides d’évaluation de la productivité des scientifiques ont des effets pervers. Elles restreignent la liberté scientifique et obligent les chercheurs à privilégier les résultats à court terme. Nos scientifiques sont donc soumis à de fortes pressions, pour des salaires très modestes. Il est donc de plus en plus difficile de trouver des gens talentueux qui acceptent de se consacrer à la recherche dans ces conditions ! 

Qu’en est-il de la fuite des « cerveaux » Belges et Européens vers les États-Unis ! Comment stopper l’hémorragie ?
Dans le contexte européen actuel, nous ne devrions pas nous tracasser du départ de chercheurs vers d’autres horizons. En effet, le fait que certains de nos chercheurs partent à l’étranger est en quelque sorte la reconnaissance de la qualité de nos universités. Ce qui me semble par contre plus inquiétant, c’est que nous ne parvenons pas à attirer suffisamment de chercheurs belges ou autres (situés à l’étranger) vers nos propres centres de recherche. Alors que nous sommes souvent compétitifs sur le plan scientifique, nous ne pouvons malheureusement pas offrir aux chercheurs un salaire équivalent à celui qu’ils pourraient obtenir aux États-Unis et dans certains autres pays européens. Nous devons trouver une solution à ce problème.

Privilégier des collaborations libres, mais transparentes
Faut-il favoriser les collaborations internationales ? 
Les scientifiques sont très fréquemment amenés à collaborer avec d’autres équipes nationales et internationales. Toutefois, rien n’est plus contre-productif que d’imposer de telles collaborations en vue d’obtenir un financement. Cette approche conduit immanquablement à des réseaux de collaborations artificielles. 

Il me semble plus important de juger une recherche sur ses résultats, plutôt que sur l’établissement de diverses collaborations. À cet égard, le caractère libre, mais transparent proposé par la Fondation contre le Cancer lors de l’octroi des crédits de recherche me paraît être un exemple à suivre !

Des études qui permettent d’espérer
Quel impact aura votre nomination au sein de la National Academy of Sciences sur la poursuite de vos travaux ? Et quel avenir envisagez-vous pour l’immunothérapie en cancérologie ?
Cette nomination est une belle reconnaissance de tout le travail qui a été mené par nos équipes belges dans la compréhension et le développement de l’immunothérapie tumorale. J’en suis honoré, mais j’éprouve surtout un sentiment de fierté vis-à-vis de notre équipe de recherche qui va poursuivre sans moi… mon parcours professionnel touchant à sa fin !

Quant à l’avenir de l’immunothérapie en cancérologie, je reste optimiste. Un essai clinique récent, mené par l’entreprise GlaxoSmithKline sur des patients atteints de cancer du poumon, a donné des résultats prometteurs. Un essai sur un plus grand nombre de malades vient de commencer. L’objectif de cette étude est de vérifier si l’on peut vacciner efficacement ces patients contre leur propre tumeur. Cette vaccination agirait en réveillant l’immunité antitumorale spontanée, laquelle étant parfois insuffisante pour éliminer la tumeur naturellement. Si les résultats confirment nos espoirs, nous aurons l’occasion d’en reparler plus longuement !



La voie JAK-STAT : de la transduction du signal à la tumorigenèse

Dr. Laurent Knoops, MD, PhD.
Unité de Médecine Expérimentale, de Duve Institute, Université Catholique de Louvain, et Service d’Hématologie, Cliniques Universitaires Saint-Luc


Laurent.Knoops@uclouvain.be



La voie JAK-STAT

Les cytokines sont des petites protéines de communication qui sont essentielles dans le dialogue mené entre les différentes cellules de l’organisme. Elles sont nécessaires pour le bon fonctionnement du système immunitaire, mais jouent également des rôles importants d’autres processus physiologiques comme l’hématopoïèse, c'est-à-dire la production par la moelle osseuse de globules blancs, de globules rouges et de plaquettes sanguines. Une fois sécrétées, elles se lient à leur récepteur sur les cellules cibles. En aval du récepteur, l’ensemble des mécanismes qui mèneront aux modifications de l’activité et de la fonction cellulaire s’appelle la transduction du signal.

Les protéines JAK et STAT sont responsables de la transduction du signal pour plus de 50 récepteurs aux cytokines, dont la majorité des interleukines et des interférons. Ces récepteurs sont composés de deux chaînes qui forment des hétéro- ou des homodimères. La caractéristique commune à ces récepteurs est de ne pas posséder d’activité enzymatique intrinsèque. Cependant, l’activité tyrosine kinase, ou la phosphorylation de tyrosines dans la partie intracytoplasmique du récepteur est essentielle pour initier les mécanismes de transduction du signal. Dès lors, pour être fonctionnels, ces récepteurs vont s’associer de manière spécifique et non covalente à des tyrosines kinases, les JAKs. 

La liaison de la cytokine à son récepteur entraînera une modification conformationelle du complexe qui rapprochera les JAKs et permettra leur transphosphorylation. Ces JAKs, ainsi activées, vont phosphoryler des tyrosines dans la partie intracytoplasmique du récepteur. Ces phospho-tyrosines serviront de point d’ancrage à des protéines appelées les STATs. Les STATs, recrutées par le récepteur activé, vont à leur tour être phosphorylées et migrer vers le noyau pour induire la transcription d’une série de gènes impliqués dans la réponse aux cytokines (voir Figure 1). C’est cette cascade de réactions biochimiques induite par la fixation d’une cytokine à son récepteur que l’on appelle « la voie JAK-STAT ». Étant donné qu’il n’existe que 4 JAKs (JAK1, JAK2, JAK3 et Tyk2), leur liaison sera partagée par plusieurs chaînes de récepteurs. Tout comme les JAKs, il n’existe qu’un nombre limité de STATs (STAT1 à STAT6), qui seront spécifiquement activées par différents types de récepteurs. 

Quand le système ne fonctionne pas : Le déficit immunitaire combiné sévère.

Les interleukines 2, 4, 7, 9, 15 et 21 sont des cytokines essentielles pour le développement et la fonction du système immunitaire. Leurs récepteurs sont formés d’une chaîne spécifique à chacune de ces cytokines, la chaîne alpha, qui se lie à JAK1, et d’une chaîne commune, la chaîne gamma, qui est associée à JAK3. Contrairement aux autres JAKs, l’association de JAK3 à la chaîne gamma est spécifique et n’est pas partagée par d’autres récepteurs.

Les souris modifiées génétiquement pour être déficientes (knock-out) en chaîne gamma ou en JAK3 sont viables, mais leurs lymphocytes ne se développent pas, si bien qu’elles présentent une déficience immunitaire sévère. Le même tableau clinique a pu être observé chez certains enfants atteints de déficit immunitaire combiné sévère. On parle parfois d’« enfants bulles », car on doit les isoler totalement des microorganismes présents dans l’environnement en l’attente d’un traitement comme une greffe de moelle. Des mutations observées dans la chaîne gamma, dont le gène se trouve au niveau du chromosome X, expliquent certains cas de déficit immunitaire sévère lié à l’X. Chez des patients ayant le même phénotype, mais atteints d’une forme autosomique récessive de la maladie, des mutations rendant JAK3 dysfonctionnel ont pu être observées. L’importance de la voie JAK-STAT est également démontrée par le fait que les souris déficientes en JAK1 et en JAK2 ne sont pas viables.

Quand le système s’emballe : les cancers

Bien souvent, l’activation de la voie JAK-STAT est associée à la prolifération cellulaire et à la résistance au processus de mort cellulaire programmée appelé apoptose, deux caractéristiques essentielles des cellules cancéreuses. Le lien entre la voie JAK-STAT et les cancers fut d’abord illustré par la découverte de la translocation (9 ;12) dans certains cas de leucémie lymphoblastique aiguë. Cette translocation rapproche le gène de JAK2, situé sur le chromosome 9, du gène de TEL, sur le chromosome 12 et engendre la formation d’une protéine de fusion entre TEL et JAK2. TEL va induire l’activation constitutive de JAK2, c’est-à-dire son activation sans qu’une cytokine ne soit liée au récepteur. Récemment, le laboratoire de Stefan Constantinescu (Branche de Bruxelles de l’Institut Ludwig, UCL) a participé à la découverte de différentes mutations activatrices, dont la mutation V617F de JAK2, dans les syndromes myéloprolifératifs. Des mutations activatrices de JAK3 ont également été retrouvées dans certains cas de leucémie mégacaryoblastique aiguë.

Autres causes d’activation de la voie JAK-STAT: le modèle de l’interleukine-9

L’interleukine-9 (IL-9) est une cytokine qui a été découverte dans notre laboratoire il y a presque 20 ans. Elle est essentiellement sécrétée par un sous-type de lymphocyte T, les lymphocytes T CD4+ (T helper) de type 2 (TH2), qui sont des lymphocytes impliqués dans la défense contre les infections parasitaires. La sécrétion inappropriée des cytokines TH2 provoque les réactions allergiques, et l’IL-9 est impliquée dans l’asthme.

Le récepteur de l’IL-9 est composé de deux chaînes : une chaîne spécifique, la chaîne alpha, qui se lie à JAK1. L’autre chaîne est la chaîne gamma, qui est partagée avec d’autres récepteurs et se lie à JAK3. L’IL-9 active essentiellement STAT3 et STAT5.

L’implication de l’IL-9 dans la formation de tumeurs a été suggérée par l’observation des souris transgéniques pour l’IL-9. Ces souris ont été modifiées génétiquement pour produire une grande quantité d’IL-9 dans tous leurs organes. Environ 10 % de ces souris développent des lymphomes, qui résultent de la prolifération anarchique de précurseurs de lymphocytes T provenant du thymus. Ces lymphomes présentent une activation constitutive de la voie JAK-STAT, qui est certainement impliquée dans la lymphomagenèse. Les causes de cette activation constitutive sont en cours d’investigation.

Un autre modèle nous a permis d’étudier de nouvelles causes d’activation de la voie-JAK-STAT qui pourraient être impliquées dans le cancer : l’étude, in vitro, dans des boîtes de culture, de la lignée cellulaire Ba/F3. Cette lignée cellulaire ne peut pas proliférer sans cytokine, et meurt en l’absence facteurs de croissance dans son milieu de culture. Par contre, si on les stimule avec de l’interleukine-3, on observe une belle prolifération. Nous avons introduit un récepteur de l’IL-9 modifié dans ces cellules. Dans ces conditions, les cellules Ba/F3 répondent très peu à l’IL-9 et meurent pour la plupart. Cependant, nous avons pu sélectionner une lignée Ba/F3 qui était capable de proliférer en présence d’IL-9. La principale caractéristique de cette lignée est qu’elle pouvait donner lieu à des cellules qui proliféraient sans présence de cytokines, de manière autonome, ce qui n’arrive jamais avec les cellules parentales. Cette prolifération anarchique sans présence de facteurs de croissance est également une caractéristique de beaucoup de cellules cancéreuses. Les cellules autonomes possédaient une activation constitutive de la voie JAK-STAT. En utilisant la technique du microarray, une technique qui permet d’avoir une idée du degré d’expression de l’ensemble des gènes (nous en possédons environ 30 000, comme la souris), nous avons pu démontrer que ces cellules étaient devenues autonomes grâce à l’expression exagérée de JAK1. Nous avons montré que la surexpression de tous les membres de la famille JAK permettait d’obtenir des cellules BAF-3 autonomes possédant une activation de la voie JAK-STAT . Ce mécanisme de surexpression peut être ajouté à la liste des mécanismes d’oncogenèse contribuant à l’activation constitutive de la voie JAK-STAT. Ce phénomène pourrait être impliqué dans le lymphome de Hodgkin ou les cancers du sein où une surexpression des JAKs a été observée.

Conclusion

Les cytokines, leurs récepteurs, ainsi que la voie JAK-STAT qui transmet leurs signaux d’activation à travers les cellules représentent autant de protéines essentielles au bon fonctionnement de nos cellules sanguines et immunitaires. En leur absence, la production de globules blancs ou de globules rouges est sévèrement compromise. Inversement, leur activation exagérée favorise le développement de cellules cancéreuses. Cette dernière découverte, relativement récente, a ouvert de nouvelles perspectives de traitement pour de nouveaux médicaments qui pourraient cibler spécifiquement cette vois JAK-STAT hyperactive dans certaines tumeurs.
 
Figure 1 : La voie JAK-STAT


Figure 1 : La voie JAK-STAT. La liaison d’une cytokine à son récepteur à la surface de la cellule induit un changement conformationnel dans la partie intracytoplasmique du récepteur. Les JAKs sont activées, auto- et transphosphorylées et phosphorylent le récepteur sur des résidus tyrosine spécifiques. Les phosphotyrosines servent de site d’ancrage pour les facteurs de transcription STATs, qui sont à leur tour phosphorylés par les JAKs. Les STATs dimérisent, migrent vers le noyau et se fixent à des séquences d’ADN spécifiques dans le promoteur des gènes induits par les cytokines.

La mutation JAK2 V617F dans les syndromes myéloprolifératifs

Dr Michael Girardot, PhD et Prof. Stefan N. Constantinescu, MD, PhD, Prof.
Institut de Duve, Université catholique de Louvain et Institut Ludwig pour la Recherche contre le cancer
michael.girardot@bru.licr.org
stefan.constantinescu@bru.licr.org

Les syndromes myéloprolifératifs humains regroupent la leucémie myéloïde chronique, dont l’événement oncogénique initial est une translocation réciproque du chromosome 9 et 22 qui place le gène ABL sous le contrôle du promoteur de BCR, la polyglobulie essentielle ou maladie de Vaquez (PV), la thrombocytémie essentielle (TE), et la splénomégalie myéloïde ou myélofibrose idiopathique chronique (IMF). Ces trois dernières sont négatives pour Bcr-Abl et font l’objet de cet article. Ces maladies hématopoïétiques malignes résultantes de la transformation de cellules souches hématopoïétiques pluripotentes sont caractérisées par une augmentation de la production des cellules sanguines avec une prédominance d’une des lignées myéloïdes.  Chaque lignée myéloïde est dépendante d’une ou plusieurs cytokines pour leur prolifération et leur différenciation.

De l’action des cytokines à la transduction du signal.

Les cytokines et leurs récepteurs sont essentiels pour la formation des cellules sanguines matures et pour la fonction du système immunitaire. La signalisation par les récepteurs aux cytokines induit l’activation des Janus tyrosine kinases (JAK) cytosoliques. Ces kinases phosphorylent des protéines cibles, comme les récepteurs eux-mêmes, les protéines STAT (Signal Transducers and Activators of Transcription) et de nombreuses autres protéines de signalisation. 
Il existe 4 types de Janus protéine kinases (JAKs) connues (JAK1, JAK2, JAK3 et Tyk2). Ces enzymes de haut poids moléculaire (120 à 140 kDa) possèdent sept domaines d’homologie (noté de JH1 à JH7). En plus d’un domaine de fixation aux extrémités cytosoliques des récepteurs aux cytokines (domaine FERM :JH7 à JH4) et d’un domaine de liaison aux résidus tyrosine phosphorylés (domaine SH2 : JH4 et JH3), les JAKs possèdent un domaine kinase (JH1) et pseudokinase (JH2) (Figure 1). Ces derniers ont des séquences très similaires et l’on pense qu’ils adoptent une même structure tridimensionnelle. Mais bien que le domaine kinase soit catalytiquement actif, le domaine pseudokinase est inactif. Le repliement du domaine pseudokinase sur le domaine kinase bloque l’accès des substrats aux résidus catalytiques du domaine kinase. Ainsi, les JAKs ne phosphorylent pas leurs protéines cibles à l’état natif. 
La fixation des cytokines induit un changement de conformation de leurs récepteurs dimériques (comme pour le récepteur à l’érythropoïétine), notamment par une rotation relative des deux domaines transmembranaires. Cette rotation imprime aussi une rotation des hélices ? juxtamembranaires de la partie cytosolique des récepteurs et a pour conséquence un rapprochement des deux protéines JAKs qui y sont fixées. Les deux JAKs peuvent alors catalyser leur phosphorylation mutuelle sur une boucle activatrice qui sera rejetée du domaine catalytique et interagira plus favorablement avec le domaine pseudokinase se trouvant à proximité. Dans cette conformation, les domaines catalytiques des JAKs sont ouverts pour phosphoryler les résidus tyrosines présent sur les domaines intracytosoliques des récepteurs ainsi que les protéines de signalisation comme les facteurs de transcription STAT qui se fixent aux résidus phosphorylé des récepteurs. Les STAT phosphorylés se dimérisent, et après leur translocation dans le noyau, peuvent se fixer sur leurs sites de liaison à l’ADN et induire l’activation de la transcription de leurs gènes cibles et ainsi initier les programmes de prolifération et de différenciation des progéniteurs hématopoïétiques (Figure 2).

Du rôle de JAK2 à la découverte du mutant JAK2 V617F.

JAK2 est crucial pour la signalisation par de nombreux récepteurs aux cytokines, comme les récepteurs à l’érythropoïétine (EpoR), à la trombopoïétine (TpoR), à l’interleukine 3 et à l’hormone de croissance. En plus de leur rôle dans la signalisation, les JAKs semblent jouer un rôle de chaperonne pour le transport des récepteurs aux cytokines à la surface cellulaire.
 La polyglobulie essentielle ou Polycythemia Vera (PV), encore appelée maladie de Vaquez, est caractérisée par une production excessive de globules rouges matures et parfois de plaquettes et granulocytes. Les progéniteurs érythroïdes dans la PV sont hypersensibles à l’Érythropoïétine (Epo) ou indépendants de l’Epo pour la prolifération et la différenciation. Curieusement, le trafic du TpoR est déficient dans les progéniteurs myéloïdes des PV. L’origine de ce travail est la démonstration que JAK2 pouvait améliorer fortement la maturation et la localisation à la surface cellulaire du TpoR. Cela nous indiquait que JAK2 ou d’autres protéines liées à JAK2 pouvaient être à l’origine des PV.
C’est ainsi que nous avons participé à la découverte d’une nouvelle mutation ponctuelle de JAK2, en collaboration avec le Prof. William Vainchenker et son unité INSERM à l’institut Gustave Roussy de Paris (Nature.2005 ;434(7037) :144-8). Cette unique mutation de la Valine 617 en Phénylalanine (V617F) dans le domaine pseudokinase rend l’enzyme constitutivement active. En effet, la mutation modifie l’inhibition physiologique exercée par le domaine pseudokinase sur le domaine kinase en permettant la mobilité de la boucle activatrice en l’absence de phosphorylation. Par conséquent, la protéine mutante JAK2 V617F est capable de se fixer aux récepteurs aux cytokines, les phosphoryler en l’absence de cytokine et activer les différentes protéines de transduction du signal liées à ces récepteurs. 

De la mutation JAK2 au diagnostic moléculaire des maladies myéloprolifératives.

Cette mutation est présente chez >90 % des patients PV et 50 % des Thrombocytémies Essentielles et Myelofibroses Idiopathiques (IMF). Puisque cette mutation est caractéristique de la plupart des syndromes myéloprolifératifs et surtout de la majorité des PV, nous avons mis au point un diagnostic moléculaire pour le dépistage précoce de ces maladies. 
Le premier test consiste en une réaction de PCR sur de l’ADN de sang à l’aide de deux amorces flanquant le site muté et d’une troisième amorce qui s’hybride sur l’ADN uniquement si le site d’intérêt est muté. Suite à l’amplification, on obtient des fragments d’ADN de grande taille grâce aux amorces flanquantes qui amplifient aussi bien la forme mutante que normale du gène, et des fragments de petite taille uniquement si la forme mutée du gène JAK2 était présente dans l’échantillon d’ADN de sang du patient (Figure 3).
Bien que ce test soit rapide et sensible, il ne permet pas d’évaluer la proportion de la version mutante du gène par rapport à la version normale du gène JAK2. C’est pourquoi nous utilisons aussi un deuxième test basé sur la technique TaqMan®. En plus des deux amorces flanquantes, deux sondes reconnaissant soit la forme mutée soit la forme normale du gène et marquées chacune d’une molécule fluorescente différente, sont hybridées sur leur site complémentaire. Au cours de l’amplification du fragment d’ADN, la sonde hybridée sur le site d’intérêt est dégradée permettant la libération de la molécule fluorescente dans le milieu qui peut alors émettre de la lumière. En quantifiant l’intensité lumineuse des deux molécules fluorescentes différentes (l’une correspondant à la forme mutée et l’autre à la forme normale du gène), on peut alors déterminer le pourcentage de forme mutante du gène JAK2 dans l’échantillon d’ADN de sang du patient (Figure 4).
Actuellement, près de 260 échantillons d’ADN de patients des Cliniques universitaires Saint-Luc ont été testés au laboratoire dont 105 étaient positifs pour la mutation JAK2 V617F. Ces deux tests sont en cours de transfert vers le service de biologie moléculaire des Cliniques pour un fonctionnement en routine du diagnostic moléculaire des maladies myéloprolifératives.

Du diagnostic moléculaire à la recherche de nouvelles mutations.

La mutation JAK2 V617F est à l’origine des trois maladies myéloprolifératives Bcr-Abl négatives (elle est présente dans >90 % des PV et 50 % des ET et IMF). Une certaine fraction de patients peut évoluer d’un syndrome à l’autre (environ 15 % des PV évoluent vers une IMF). L’hypothèse actuelle suggère que de légères variations de l’activité kinase de JAK2 V617F pourraient profondément changer le phénotype de la maladie. Bien que cette mutation explique la majorité des cas de PV chez l’adulte, elle n’est pas à l’origine de tous les cas de ET et d’ IMF. C’est pourquoi notre hypothèse actuelle est qu’il doit exister d’autres mutations présentes seules ou en combinaison avec l’allèle JAK2 V617F.
Le récepteur à la thrombopoïétine (TpoR) et son ligand régulent la prolifération des progéniteurs mégacaryocytaires, leur différenciation, la formation des plaquettes, ainsi que le renouvellement des cellules souches hématopoïétiques. Il est démontré que JAK2 est essentielle à la transduction du signal suite à la fixation de Tpo sur son récepteur. Cette relation étroite entre TpoR et JAK2 laisse penser qu’une activation constitutive de TpoR pourrait avoir les mêmes conséquences que JAK2 V617F. En effet, notre équipe a récemment mis en évidence le rôle inhibiteur pour la dimerisation et l’activation du TpoR par un motif juxtamembranaire unique à ce récepteur. Lorsque ce motif à la jonction entre le domaine transmembranaire et cytoplasmique est supprimé expérimentalement, TpoR est constitutivement actif. Ce motif pourrait être la cible de mutations activatrices dans les maladies myéloprolifératives. En effet, des travaux récents semblent indiquer que la mutation de ce motif (TpoRW515L) serait présente chez 5 à 10 % des patients atteints de myélofibrose qui ne sont pas porteurs de la mutation JAK2 V617F.

L’objectif de notre laboratoire, ainsi que celui de beaucoup d’autres, est d’identifier les évènements moléculaires associés à la mutation ponctuelle JAK2 V617F induisant, chez l’homme, et chez la souris de manière expérimentale, trois syndromes myéloprolifératifs apparentés (PV, ET et IMF) ainsi que les évènements secondaires entraînant leur transformation en leucémie myéloïde aigue. Par ailleurs, nous sommes à la recherche d’autres défauts moléculaires impliqués chez les 40 à 50% des patients ET et IMF qui ne sont pas porteurs de la mutation JAK2 V617F.

Vers une classification histomoléculaire des tumeurs cérébrales

Prof Catherine Godfraind, anatomopathologiste
Prof Miikka Vikkula, généticien moléculaire
Catherine.Godfraind@anpg.ucl.ac.be
miikka.vikkula@uclouvain.be

Giovanni Battista Morgagni, professeur d’anatomie à l’université de Padoue, fonde les bases de l’anatomie pathologique en publiant, en 1761, « De sedibus et causis morborum per anatomen indagatis », dans lequel il collige des corrélations établies au cours de 640 autopsies et définit les premières relations entre sémiologie clinique et lésions macroscopiques. Au cours de la seconde moitié du XVIIIe siècle, Guillaume Dupuytren commence à classifier les lésions, méthode qui, aujourd’hui encore, est la pierre angulaire de l’anatomie pathologique. En 1858, Rudolph Virchow établit la notion de pathologie cellulaire en publiant “Die Zellullarpathologie”, un traité dans lequel il définit que l’explication ultime des processus normaux et pathologiques doit être recherchée au niveau cellulaire. Enfin, un siècle plus tard (1959), Raymond Turpin et Jérôme Lejeune associent le syndrome de Down à la présence d’un chromosome 21 surnuméraire, ouvrant ainsi la porte à la classification génétique. La génétique constitue aujourd’hui un apport pour le pathologiste afin de différencier des lésions d’aspect morphologique semblable, mais d’évolution clinique distincte. 

C’est au travail d’analyse anatomoclinique de deux neurochirurgiens américains, Percival Bailey et Harvey William Cushing, que l’on doit la classification des tumeurs cérébrales sur laquelle se base l’actuelle classification de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Cette classification est, comme toute classification, imparfaite, mais elle évolue. En effet, dans sa prochaine édition, de nouvelles entités tumorales seront incluses comme, par exemple, la tumeur neurono-gliale, le gliome angiocentrique et l’astrocytome pilo-myxoïde 1. Malgré cela, les critères histologiques restent parfois imprécis, amenant des discordances diagnostiques pouvant avoir une répercussion sur le traitement du patient. C’est pourquoi nous nous sommes particulièrement intéressés à deux types de gliomes, afin (1) de mieux comprendre les étapes de leur oncogenèse, (2) de mieux les différencier par rapport aux autres tumeurs cérébrales et (3) au sein d’un même type de gliome, de définir des sous-entités. 

Oligodendrogliome

En 1994, Cairncross démontre que l’oligodendrogliome, une tumeur développée à partir des oligodendrocytes, répond au PCV (procarbazine, lomustine et vincristine). C’est la première fois que l’on prouve qu’une tumeur cérébrale répond à une chimiothérapie. De ce fait, et comme la définition histologique de l’oligodendrogliome était alors controversée (cette tumeur n’étant pas toujours bien distinguée de l’astrocytome et de l’oligoastrocytome), on a vu une augmentation de la fréquence du diagnostic d’oligodendrogliome. Quatre ans plus tard, Cairncross associe la réponse au PCV à la présence d’une délétion conjointe des bras chromosomiques 1p et 19q.

Pour préciser l’aspect histologique des gliomes porteurs de délétion 1p/19q, nous avons analysé une série de 45 gliomes provenant des Cliniques Saint- Luc et de l’Institute of Neurology, Londres 2. Le diagnostic histologique de départ correspondait pour 21 d’entre eux à celui d’oligodendrogliome, pour 10 à celui d’oligoastrocytome, et pour 14 à celui d’astrocytome. La recherche de délétions de 1p/19q a été réalisée par analyse de pertes d’hétérozygotie au niveau de marqueurs polymorphiques des chromosomes 1 et 19. Le génome humain contient plusieurs types de marqueurs polymorphiques qui sont géographiquement spécifiques d’une région précise. Nous avons utilisé des microsatellites, constitués d’une séquence répétitive formée de 2 à 4 nucléotides. Pour chaque individu, ces marqueurs peuvent être homo- ou hétérozygotes, c’est-à-dire constitués de deux allèles identiques (contenant le même nombre de séquences répétitives) ou de deux allèles distincts (contenant un nombre différent de séquences répétitives). En comparant, dans une tumeur et dans le sang du patient, les mêmes microsatellites, il est possible de définir si la région chromosomique d’intérêt est ou non perdue dans la tumeur (Figure 1). En effet, un cancer résulte d’altérations génétiques somatiques et le sang du patient est un témoin du statut génétique germinal.

Nous avons défini, dans notre série, que tout gliome qui présente une région constituée de cellules rondes et claires, et où les vaisseaux sont fins et s’organisent en pieds de poule (Figure 2A), est porteur d’une délétion de 1p/19q. Devant cet aspect histologique, l’anatomopathologiste pourra donc soupçonner, avant analyse génétique, la présence d’une délétion de 1p/19q, et ce même en présence de zones d’aspect histologique différent (Figures 2B et 2C). Sur cette série de tumeurs, nous avons également analysé d’autres altérations chromosomiques, permettant de proposer un schéma de progression tumorale associant aspects histologiques et altérations génétiques (Figure 3). 

Fin 2006, Griffin CA et collaborateurs ainsi que Jenkins RB et collaborateurs suggèrent que la délétion de 1p/19q résulte de deux altérations chromosomiques successives. Dans un premier temps, on observe une translocation balancée (1;19)(q10;p10). Ensuite, un des deux réarrangements chromosomiques est perdu, ce qui engendre une délétion de 1p/19q. Ceci expliquerait pourquoi, dans des gliomes présentant l’aspect histologique défini ci-dessus (Figure 2), on ne trouve pas toujours de délétion de 1p/19q. Il s’agirait de tumeurs encore porteuses de t(1;19)(q10;p10) balancée. Enfin, Jean-Louis Boulay et coauteurs viennent de démontrer que le point de cassure sur le chromosome 1 se produit au niveau de Notch2. La perte de ce gène centromérique conférerait à la tumeur sa chimiosensibilité.

Tumeurs épendymaires

Les tumeurs épendymaires peuvent se développer à tous les âges de la vie et dans tous les compartiments du système nerveux central. Elles dérivent des cellules épendymaires, cellules qui tapissent la lumière du système ventriculaire et les restes du canal médullaire. L’OMS les répartit en 4 groupes histologiques principaux et leur attribue 3 grades pronostiques : les épendymomes myxo-papillaires et les sub-épendymomes (grade 1 OMS), les épendymomes (grade 2 OMS) et les épendymomes anaplasiques (grade 3 OMS). Cependant, les tumeurs classées selon ce grading ne suivent pas des courbes de survie distinctes. C’est pourquoi un groupe de neuropathologistes et d’oncologues travaille sous l’égide de la Société Internationale d’Oncologie Pédiatrique afin d’établir des critères consensuels et reproductibles de grading qui permettront de proposer des approches thérapeutiques différenciées. 

Nous nous sommes intéressés à préciser les critères histologiques et moléculaires de ces tumeurs. Cela nous a permis d’identifier une nouvelle association histogénétique 3. Dans cette entité, 100 % des tumeurs dont nous avons profilé le génome par hybridation génomique comparative, en employant des puces à damier, étaient porteuses d’une trisomie au moins partielle du chromosome 19 (Figure 4). Toutes avaient aussi, au moins, une anomalie chromosomique additionnelle correspondant à une délétion de 13q21.31-31.2, à une délétion, au moins partielle, du chromosome 9, et/ou à une amplification de 11q13.3-13.4. Nous avons également observé que cette entité était histologiquement caractéristique. Elle forme une tumeur compacte présentant une interface nette avec le parenchyme sain (Figure 5A). Elle a un aspect lobulé de par sa vascularisation constituée d’un riche réseau de petits capillaires branchés (Figure 5A). Les cellules tumorales y sont distribuées de façon régulière, mais leur aspect cytoplasmique est variable. Certaines tumeurs se présentent sous forme de tumeur à cellules claires à l’instar de l’oligodendrogliome (Figure 5B), d’autres sont constituées de cellules plus primitives rappelant l’aspect des cellules des tumeurs primitives neuro-ectodermiques (Fig. 5C), et certaines enfin sont formées de cellules plus fusiformes, donnant le change avec un oligoastrocytome (Figure 5D). Elles ont généralement un grade 3 OMS. Au moins focalement, ces tumeurs ont les caractéristiques immunohistochimiques des épendymomes : elles sont positives pour la GFAP et l’EMA. Cliniquement, elles constituent aussi un groupe homogène. Les épendymomes avec trisomie 19 sont supratentorielles et atteignent surtout l’adolescent ou le jeune adulte. 

Isoler une entité histomoléculaire au sein des épendymomes ne nous a pas réellement surpris. En effet, nous avions démontré que selon des caractéristiques anatomocliniques, le profil de méthylation de certains gènes suppresseurs de tumeur varie (Fig. 6, 4). La méthylation du promoteur d’un gène est un mécanisme physiologique que la cellule emploie pour éteindre (méthylation) ou allumer (déméthylation) des gènes. Le cancer détourne ce mécanisme à son propre intérêt. Ainsi, par exemple, nous avons montré que les épendymomes myxopapillaires de la queue de cheval sont plus fréquemment méthylés pour CDKN2B (p15) que les autres tumeurs épendymaires. Ou encore, CDKN2A (p16) est plus souvent méthylé chez l’adulte que chez l’enfant dans les épendymomes de la fosse postérieure. 

Ces études laissent à penser que, si les épendymomes se ressemblent par leur aspect histologique, ils correspondent génétiquement à des tumeurs distinctes. Leurs comportements cliniques pourraient donc varier à même grade OMS. Dans le but d’approfondir cette notion, nous avons récolté une série d’épendymomes congelés. Ces tumeurs ont été profilées sur le plan ADN et ARN. De premières analyses histogénétiques ont confirmé l’hétérogénéité des tumeurs épendymaires. Cela suggère qu’elles pourraient bénéficier de traitements différenciés en fonction de leur profil moléculaire (T. Palm, manuscrit en préparation, Figure 7).

Perspectives

Notre approche démontre l’intérêt d’associer, à une classification histologique, des critères moléculaires. Ceci permet de définir des groupes tumoraux homogènes, mais aussi de mieux cerner individuellement chaque tumeur. Au cours de nos analyses, nous avons été intrigués par un épendymome dont le profil d’expression suivait celui des grades 2 OMS, si ce n’est qu’il présentait aussi une augmentation inhabituelle de l’expression des gènes de l’angiogenèse. De façon intéressante, l’histologie de cette tumeur correspondait à une lésion de grade 2 OMS, mais démontrait également une petite zone de prolifération vasculaire. Certains neuropathologistes auraient diagnostiqué une tumeur de grade 3. Comment faudra-t-il dans le futur traiter de telles lésions: comme une tumeur de grade 2 ou comme une tumeur angiogénique? 
Il existe aussi des problèmes classiques de diagnostic différentiel, dont celui des tumeurs à cellules claires. Ces tumeurs comprennent l’oligodendrogliome, l’épendymome avec trisomie 19, le neurocytome central et la DNET (dysembryoplastic neuroepithelial tumor). Lorsque l’analyse histologique ne nous permet pas de résoudre ce diagnostic différentiel, la recherche de la perte de 1p/19q et de la présence ou non d’une trisomie 19 peut établir un diagnostic pour 2 de ces 4 tumeurs. 

Remerciements

Nous souhaitons remercier nos collègues : le Professeur I. Salmon, Erasme ; le Dr C. Vandenbroeck, Gand ; le Professeur F. Gray, Lariboisière ; le Dr C. Lacroix, Le Kremlin-Bicêtre ; le Professeur F. Chapon, Caen ; le Professeur D. Figarella-Branger, Marseille ; le Professeur D. Ellison, NewCastle Upon Tyne ; le Professeur MM. Ruchoux, Lille ; et le Professeur F. Scaravilli, Londres, qui nous ont fait confiance et nous ont permis d’accéder à leur matériel tumoral. Avec ces mêmes collègues, et en particulier les Professeurs F. Scaravilli (Institute of Neurology, Londres) et P. Burger (John Hopkins, Baltimore), nous avons eu de nombreuses discussions neuropathologiques qui se sont révélées fructueuses dans le développement de notre travail. Nos remerciements s’adressent aussi à Madame E. Verhamme, qui assure depuis de nombreuses années la recherche de délétion de 1p/19q pour nos patients.

Ce travail a reçu le soutien de nombreux Fonds et nous les en remercions : la Fondation Médicale Reine Elisabeth, la Fondation contre le Cancer, le Fonds National de la Recherche Scientifique, le Télévie, le FRIA, le Fonds Maisin, le Fonds du patrimoine et le Fonds spécial de la recherche scientifique (UCL). M.V. est Maître de recherches du F.N.R.S.

Références

1. Tihan T, Fisher PG, Kepner JL, Godfraind C, McComb RD, Goldthwaite PT, Burger PC: Pediatric astrocytomas with monomorphous pilomyxoid features and a less favorable outcome, J Neuropathol Exp Neurol 1999, 58:1061-1068
2. Godfraind C, Rousseau E, Ruchoux MM, Scaravilli F, Vikkula M: Tumour necrosis and microvascular proliferation are associated with 9p deletion and CDKN2A alterations in 1p/19q-deleted oligodendrogliomas, Neuropathol Appl Neurobiol 2003, 29:462-471
3. Rousseau E, Palm T, Scaravilli F, Ruchoux M, Figarella-Branger D, Salmon I, Ellison D, Lacroix C, Chapon F, Mikol J, Vikkula M, Godfraind C: Trisomy 19 ependymoma, a newly recognized genetico-histological association, including clear cell ependymoma, Molecular cancer 2007, in press
4. Rousseau E, Ruchoux MM, Scaravilli F, Chapon F, Vinchon M, De Smet C, Godfraind C, Vikkula M: CDKN2A, CDKN2B and p14ARF are frequently and differentially methylated in ependymal tumours, Neuropathol Appl Neurobiol 2003, 29:574-583


Facteurs prédictifs de réponse thérapeutique ou de rechute tumorale : application au cancer de la vessie

Anne-France Dekairelle, Dr Sébastien Van der Vorst, Prof Jean-Luc Gala 
Centre for Applied Molecular Technologies ( CTMA ).Université catholique de Louvain.

Anne-France.Dekairelle@uclouvain.be
gala@lbcm.ucl.ac.be


Le cancer de la vessie représente le 4ème cancer le plus fréquent chez l’homme (6,9 % en Belgique) et le 10ème chez la femme. Plus de 330000 nouveaux cas sont diagnostiqués chaque année dans le monde. Il est trois fois plus présent chez l’homme que chez la femme et son incidence augmente avec l’âge : dans ~80 % des cas, le diagnostic est posé chez des patients de plus de 60 ans, et dans plus de 50 % chez des personnes de 70 ans et plus.  
Plus de 90 % des cancers de la vessie nouvellement diagnostiqués sont des carcinomes transitionnels (TCC). Approximativement 75% des patients présentent un cancer superficiel, 20 % une maladie invasive et 5 % une maladie métastatique au premier diagnostic. Si les cancers superficiels sont moins graves que les invasifs, ces tumeurs récidivent dans 30 à 90 % des cas et deviennent invasives dans 15 à 20 % des cas.

Les approches classiques utilisées pour diagnostiquer le cancer de la vessie sont l’analyse cytologique de l’urine et la cystoscopie (technique coûteuse et invasive), et pour déterminer le pronostic l’analyse des données histopathologiques (stade et grade tumoral). Cependant, toutes ces techniques manquent de sensibilité pour permettre une détection adéquate ainsi qu’une prédiction précise de l’évolution tumorale, spécialement pour les lésions superficielles de faible grade. La nécessité de prédire quelle tumeur superficielle va rechuter ou progresser ou quelle tumeur invasive va métastaser a conduit à l’identification d’une variété de marqueurs biologiques diagnostiques et pronostiques potentiels. Les changements moléculaires qui se déroulent dans les carcinomes transitionnels de la vessie sont nombreux et peuvent être répertoriés en 3 catégories : (1) les altérations chromosomiques conduisant à la carcinogenèse, (2) la perte de régulation du cycle cellulaire menant à une prolifération cellulaire anarchique, et (3) une modification de l’angiogenèse permettant la croissance tumorale et/ou l’apparition de métastases. 

Plusieurs biomarqueurs ont été proposés comme outil pour la prédiction précoce de la rechute tumorale, de la progression, du développement de métastases ainsi que pour la prédiction de la réponse à la thérapie : Ki-67, antigène associé à la prolifération cellulaire, marqueur de récurrence, de progression et de la survie ; Rb: marqueur du cycle cellulaire corrélé à la progression de la maladie, seul ou en association avec p53, p21 et p27 ; Bax/Bcl-2 : marqueurs de l’apoptose corrélé à la rechute et à la progression si association avec la survivin ; survivin : un inhibiteur de l’apoptose, marqueur de détection précoce du cancer de la vessie, et marqueur pour la prédiction de la récurrence dans le groupe des tumeurs Ta ; Mcm2 ( minichromosome maintenance protein 2) marqueur de rechute pour les cancers Ta-T1, …. Cependant, pour chacun de ces marqueurs, de nombreuses discordances existent dans la littérature quant à leur valeur pronostique en termes de rechute ou de prédiction de la réponse thérapeutique. 

La présence d’une mutation au sein du gène suppresseur de tumeur p53 est l’une des altérations génétiques les plus fréquentes dans de nombreux cancers, dont les carcinomes de la vessie. De nombreuses études ont donc tenté de déterminer la valeur pronostique des anomalies de la protéine p53 correspondante dans les cancers de la vessie. S’il est admis que la prévalence d’une altération génétique du gène p53 est associée au stade et/ou au grade tumoral, sa valeur en tant que facteur pronostique indépendant reste, quant à elle, encore largement discutée. Récemment, Moonen et collaborateurs n’ont montré aucune corrélation entre p53 et l’évolution clinique des carcinomes superficiels de la vessie [Moonen et al., J Urol, 177, 2007]. De même, Dalbagni et collaborateurs ont récemment conclu que l’expression de la protéine p53 n’a pas de valeur pronostique dans les tumeurs vésicales de stade T1 [Dalbagni et al., Urological Oncology, 99, 2006]. Cependant, ces études ont déterminé l’état muté ou non de p53 par séquençage direct ou par immunohistochimie, deux méthodes ne permettant pas d’appréhender l’état fonctionnel de la protéine p53, c’est-à-dire sa capacité à assurer sa fonction de facteur transcriptionnel à l’égard de nombreux gènes cibles. 

L’utilisation d’un test fonctionnel pour identifier sélectivement les mutations rendant non fonctionnelle la protéine p53 au sein des tumeurs et pour déterminer la valeur pronostique de p53 sur la rechute, la progression, … semble une approche méthodologiquement plus correcte. C’est pourquoi, au laboratoire CTMA, nous avons mis en œuvre l’utilisation d’une analyse  fonctionnelle au moyen de levures génétiquement modifiées, le FASAY (Functional Analysis of Separated Alleles in Yeast), afin d’identifier l’état de p53 et sa capacité de transactivation (Figure 1 - Figure 2). Ce test permet non seulement la détection de mutations de p53, mais également la caractérisation fonctionnelle de la protéine, c’est-à-dire déterminer sa capacité à induire les deux voies métaboliques de réponses principales : l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose.



 
FASAY : marqueur pronostique de la rechute dans les cancers de la vessie 

Au départ d’une cohorte de 53 patients atteints de carcinome transitionnel de la vessie, nous avons confirmé que l’état fonctionnel de p53 est corrélé au stade et au grade tumoral [1]. Nous avons également démontré qu’un test FASAY positif (p53 non fonctionnel) représentait la meilleure valeur prédictive de rechute, surpassant non seulement l’immunohistochimie de p53 mais également le grade tumoral (Table 1). Concernant le sous-groupe de patients présentant une tumeur Ta-T1/grade 3, nous avons également montré la forte valeur prédictive d’un p53 non fonctionnel pour la rechute. 

Actuellement, notre cohorte s’étend à 161 patients pour lesquels nous avons un résultat FASAY, avec un follow-up de 29 mois en moyenne (4-71). Les analyses de corrélations de p53 par rapport au stade, grade, rechute et progression tumorale sont en cours.

RNALater®, alternative flexible et fiable à l’azote liquide

Afin de faciliter l’étape préanalytique du FASAY, nous avons réalisé une étude comparative entre la préservation de l’échantillon dans l’azote liquide, méthode classique, et dans le RNALater®, solution commerciale permettant non seulement de ne plus avoir besoin d’azote liquide en salle d’opération, mais également un transport à température ambiante [2]. Au départ de 81 échantillons de tumeurs TCC de la vessie, nous avons démontré que le RNALater® permettait une conservation adéquate de l’échantillon en assurant une bonne qualité de l’ARN messager pour une période de 3 jours à température ambiante et jusqu’à 1 mois à 4 °C. 

Parmi ces 81 biopsies, 53 consistaient en des échantillons pairés nous permettant de prouver la valeur du RNALater® comparé à l’azote liquide (Figure 3). 

Par cette étude, nous avons démontré que le RNALater® représentait une alternative flexible à l’azote liquide pour la préservation des échantillons destinés au FASAY, permettant ainsi aux cliniciens et chercheurs ne disposant pas de facilités pour l’azote liquide d’accumuler et envoyer les échantillons au laboratoire de référence.

Protocole FASAY : améliorations

En plus de l’amélioration de l’étape préanalytique, nous avons également mené une étude comparative permettant de faciliter l’analyse FASAY et d’augmenter son rendement, via l’automatisation de la préparation de l’échantillon (Figure 4). 

Nous avons comparé la technique de broyage à froid de l’échantillon dans un mortier, méthode classique, à l’utilisation d’un robot « broyeur ». Non seulement, celui-ci nous permet de gagner un temps considérable et d’éviter le risque de contamination (tout se faisant dans des tubes fermés individuels non réutilisables), mais cette amélioration nous a surtout permis d’obtenir un ARN messager de qualité et en quantité suffisante à partir de très petites quantités de matériel de départ. Si le broyage manuel au mortier requérait une biopsie de minimum 30mg, l’utilisation du robot permet de descendre à 5mg. Cette amélioration majeure va, non seulement, permettre de réaliser l’analyse FASAY sur des patients présentant de petites tumeurs, mais également sur des échantillons récoltés de façon non invasive, tels que des frottis cellulaires endobuccaux (dans le cadre de cancers ORL) ou cellules récoltées à partir de prélèvement d’urine. 

Récemment, une étude menée par Darabi et collaborateurs [Darabi et al, Urologiacal Oncology, 3, 2006] a montré que l’expression de la protéine p53 dans les urines est représentative de l’expression de p53 au sein de la tumeur TCC de la vessie. Une étude comparative de l’état fonctionnel de p53 au départ d’échantillons urinaires de patients atteints de carcinomes transitionnels de la vessie par rapport à l’état de p53 au sein de la tumeur sera prochainement entreprise.

Enfin, nous avons également investigué avec succès la possibilité de réaliser le FASAY au départ d’ARN total sans être limité à l’extraction directe de l’ARN messager, telle que décrite dans le protocole initial (Figure 4). Cette dernière amélioration nous permettra de réaliser différentes analyses, telles que la PCR en temps réel ou la détermination du profil génique par microdamier ADN, au départ d’un même échantillon. 

Conclusion-Perspectives

La valeur prédictive que semble avoir un p53 non fonctionnel sur la rechute tumorale doit être maintenant validée sur une plus grande cohorte de patients atteints de carcinomes transitionnels de la vessie et corrélée à d’autres facteurs pronostiques. Cette étude se poursuit avec une attention particulière pour les patients présentant une tumeur Ta-T1/grade 3, groupe pour lequel de meilleurs indices prédictifs de rechute après résection transuréthrale sont toujours espérés et attendus. 
Les modifications apportées à l’analyse FASAY, tant dans le domaine préanalytique qu’analytique, simplifient ou évitent certaines contraintes limitant auparavant le recueil d’échantillons cliniques (citons la nécessité d’avoir un accès constant à l’azote liquide en salle d’opération, la nécessité d’une biopsie d’un volume minimal de 30mg, et le recours au broyage manuel de l’échantillon pour l’extraction des ARN messagers). Ces améliorations, dont nous avons vérifié qu’elles ne modifient aucunement la qualité de l’ARN messager tumoral, vont permettre l’apport de nombreux prélèvements auparavant jugés inadéquats pour ce type d’analyse. La possibilité de réaliser le FASAY au départ d’ARN total va également permettre d’associer plusieurs types d’analyses à partir de ces biopsies de carcinomes transitionnels de la vessie et ainsi d’élargir le spectre d’exploitation de ce type de tissus pour une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la rechute tumorale ou la réponse au traitement..

Publications

[1] Anne-France Dekairelle, Bertrand Tombal, Jean-Pierre Cosyns, and Jean-Luc Gala. Assessment of the Transcriptional Activity of p53 Improves the Prediction of Recurrence in SuperficialTransitional
Cell Carcinoma of the Bladder. Clin Cancer Res 2005;11, 2005.
[2] Anne-France Dekairelle, Sébastien Van Der Vorst, Bertrand Tombal and Jean-Luc Gala. Preservation of RNA for functional analysis of separated alleles in yeast: comparison of snap-frozen and RNALater® solid tissue storage methods. Clin Chem Lab Med 2007;45, 2007.

Pour un usage réfléchi des traitements antiangiogéniques

Olivier FERON
Laboratoire de Pharmacologie et de Thérapeutique, Groupe Angiogenèse et Cancer,
Université catholique de Louvain. olivier.feron@uclouvain.be

L’angiogenèse ou formation des vaisseaux sanguins est un concept qui aujourd’hui est connu de l’ensemble de la communauté scientifique médicale, mais également d’une proportion croissante du grand public. L’apparition des premiers médicaments « intelligents » dits antiangiogéniques n’est pas étrangère à cet état de fait, mais surtout, la simplicité apparente du paradigme justifie la large publicité réservée à cette thématique au cours des dernières années. Dans les tumeurs comme dans n’importe quel tissu sain, les vaisseaux sanguins sont, en effet, essentiels pour l’apport en oxygène et en éléments nutritifs ainsi que pour l’élimination des déchets du métabolisme. Il devient dès lors évident que la suppression sélective des vaisseaux sanguins au sein de la tumeur aura des conséquences dommageables pour la croissance de celle-ci [1]. 
Les principaux bénéfices des traitements antiangiogéniques sont aisément identifiables. Cinq avantages de cette chimiothérapie ciblant la vascularisation tumorale sont généralement cités. Le premier est l’effet amplificateur de l’inhibition de l’angiogenèse. En détruisant sélectivement les vaisseaux sanguins d’une tumeur, c’est la totalité de la masse tumorale qui est théoriquement amenée à disparaître. On estime aujourd’hui qu’une cellule endothéliale (ie, cellule constitutive de l’endothélium, la couche cellulaire la plus interne des vaisseaux sanguins) assure la diffusion de l’oxygène et des nutriments vers une centaine de cellules tumorales (Figure 1). Un second avantage évident est l’accessibilité. La cible privilégiée des médicaments antiangiogéniques, l’endothélium, est en contact direct avec le sang qui véhicule ces drogues en concentrations élevées. Par opposition, la chimiothérapie conventionnelle doit diffuser au-delà des vaisseaux pour atteindre l’ensemble des cellules tumorales : un gradient de concentration est donc inévitable et aboutit à une répartition hétérogène et donc une réduction de l’efficacité du médicament administré. Les troisième et quatrième avantages des approches antiangiogéniques sont intimement liés : il s’agit de la sélectivité et de l’applicabilité. Bien que les vaisseaux sanguins soient responsables de l’irrigation des différents tissus (sains) de l’organisme, des différences phénotypiques permettent de justifier la sélectivité thérapeutique des médicaments antiangiogéniques pour les vaisseaux tumoraux. Les vaisseaux sanguins d’une tumeur sont par définition « jeunes », car néoformés et présentent un profil d’expression génique différent des vaisseaux « quiescents » d’un tissu sain. La croissance tumorale ne peut en effet se satisfaire des vaisseaux préexistants. Au-delà d’une taille de quelques mm3, les cellules tumorales vont générer les signaux qui, directement ou indirectement via le recrutement d’autres cellules, vont induire la formation de nouveaux vaisseaux sanguins. Ce processus a été rapporté pour la quasi-totalité des tumeurs et justifie donc de l’applicabilité a priori sans limite des approches antiangiogéniques. Même les tumeurs « liquides » sont souvent accompagnées d’une augmentation de la vascularisation au sein de la moelle osseuse. Les seules situations associées à une angiogenèse « saine » chez l’adulte sont, de plus, gérables puisque limitées aux processus de cicatrisation, de menstruation et de grossesse. Enfin, un dernier avantage théorique et non des moindres est l’absence de résistance à ce type de traitements. Les cellules endothéliales, et par extension l’ensemble des cellules constitutives des vaisseaux, sont des cellules issues de l’hôte et donc génétiquement stables. Cette absence de plasticité génétique ne leur permet pas contrairement aux cellules tumorales de sélectionner des sous-populations de cellules capables de résister aux effets cytotoxiques des traitements administrés.
On comprend donc comment à travers ces différents avantages théoriques, l’approche antiangiogénique a rapidement revêtu les caractéristiques du « magic bullet », expression consacrée en médecine pour caricaturer le traitement idéal, qui plus est dans le contexte d’une maladie présentant des taux de mortalité très élevés comme le cancer. Toutefois, alors que les effets thérapeutiques des premiers médicaments antiangiogéniques se sont avérés spectaculaires sur modèles animaux, les premiers essais de transposition à l’homme furent décevants. Même les premiers résultats positifs dans des études randomisées statistiquement fiables, bien qu’encourageants, restent limités. Ainsi, la survie accrue de 2 à 5 mois chez des patients atteints de cancer colorectal métastatique traités en associant le bevacizumab (anticorps dirigé contre le VEGF, le principal facteur de croissance stimulant la prolifération des cellules endothéliales) à une chimiothérapie classique (IFL ou FOLFOX) fut certes un progrès indéniable dans la prise en charge de ces patients, mais ces résultats apparaissent dérisoires en comparaison aux résultats obtenus chez la souris. Chez cette dernière, le même médicament antiangiogénique permet à lui seul (ie, sans chimiothérapie associée) l’éradication de tumeurs représentant presque 10% du poids de l’animal ! 
Les raisons de ces échecs ou demi-échecs en médecine humaine commencent à être identifiées. Elles découlent pour beaucoup des modèles animaux utilisés [1]. En effet, les tumeurs obtenues chez la souris par inoculation de cellules tumorales doublent de volume en quelques jours et ont donc des besoins métaboliques énormes auxquels seule une angiogenèse très efficace  permet de pourvoir. Les tumeurs chez l’homme s’établissent plus lentement. Certaines cellules tumorales « apprennent » à vivre avec peu d’oxygène : la sélection naturelle de ces clones rend la tumeur peu dépendante de l’angiogenèse et donc moins sensible aux traitements antiangiogéniques. De plus, lorsqu’il est présent, le réseau vasculaire tumoral chez l’homme est plus mature que chez la souris : des péricytes et/ou cellules musculaires lisses recouvrent une proportion plus importante de cellules endothéliales, rendant ces dernières moins sensibles aux médicaments antiangiogéniques. Enfin, les tumeurs peuvent s’adapter aux traitements antiangiogéniques en sélectionnant des sous-populations de cellules mutées dépendantes d’une autre voie signalétique régulant l’angiogenèse que celle ciblée par le médicament antiangiogénique (eg, un anticorps anti-VEGF est sans effet sur une tumeur productrice de bFGF, un autre facteur de croissance également actif sur la prolifération des cellules endothéliales).
Pour les raisons évoquées ci-dessus, les médicaments antiangiogéniques sont donc plutôt à classer parmi les cytostatiques, incapables à eux seuls d’éradiquer complètement une tumeur. Il devient donc de plus en plus évident aujourd’hui qu’à de rares (mais non négligeables) exceptions telles que le cancer du rein, les traitements antiangiogéniques doivent être considérés non pas comme une monothérapie, mais comme une stratégie complémentaire aux autres modalités thérapeutiques. Dans les paragraphes suivants, nous illustrerons sur bases des résultats obtenus au sein de notre laboratoire comment et pourquoi la radiothérapie et l’immunothérapie ont à gagner dans une association avec un médicament antiangiogénique. Nous aborderons enfin de nouvelles pistes mises à jour dans notre laboratoire, qui permettent, par une meilleure compréhension des déterminants du phénotype angiogénique tumoral, de proposer de nouvelles stratégies de modulation de l’angiogenèse.

Radiothérapie et angiogenèse.

La radiothérapie exerce ses effets cytotoxiques sur les cellules tumorales, mais également sur les tissus sains environnants. Pour ces derniers, les effets sont d’autant plus marqués qu’il s’agit de cellules en division telles que les précurseurs des cellules sanguines au sein de la moelle osseuse ou encore les cellules épithéliales du tractus intestinal. Ces limitations justifient en grande partie les doses réduites et les schémas thérapeutiques exploités de nos jours. Les cellules qui constituent la structure d’un vaisseau tumoral, et en particulier les cellules endothéliales, sont issues du tissu hôte, mais localisées au sein de la masse tumorale et, de plus, dans un état prolifératif. Les radiations ionisantes exercent donc intrinsèquement des effets antiangiogéniques en induisant des dommages aux cellules endothéliales. Toutefois, comme pour les cellules tumorales, une proportion des cellules endothéliales tapissant les vaisseaux sanguins irriguant la tumeur vont survivre à la radiothérapie. Notre laboratoire a démontré que non seulement certaines cellules survivent, mais en plus, l’exposition aux radiations ionisantes leur confère des propriétés angiogéniques (Figure 2) ! Des tests in vitro et in vivo révèlent en effet que les cellules endothéliales (survivant à la radiothérapie) prolifèrent,  migrent et s’organisent en tubes endothéliaux, encore appelés précapillaires, de façon plus efficace que des cellules non exposées [2]. Des biopsies issues de carcinomes épidermoïdes de la sphère ORL (collaboration avec le Prof. V. Grégoire des Cliniques St Luc) prélevées avant et après la première dose (2 Gy) de radiations révèlent également l’augmentation de l’expression de eNOS (l’isoforme endothéliale de la NO synthase), une protéine jouant un rôle clé dans l’angiogenèse (voir plus bas) [2]. Ces découvertes renforcent les données d’autres laboratoires qui ont, quant à eux, identifiés que les cellules tumorales survivant à la radiothérapie produisent davantage de VEGF. L’ensemble de ces résultats indique que la stimulation de l’angiogenèse participe à une forme de résistance indirecte à la radiothérapie, les cellules tumorales survivantes retrouvant rapidement l’oxygène et les nutriments nécessaires à leur prolifération (Figure 2).  
Une nouvelle base rationnelle à la combinaison de la radiothérapie et des traitements antiangiogéniques peut donc être proposée. Alors que jusqu’alors, le seul but recherché de cette association était de cibler deux populations de cellules différentes (ie, les cellules tumorales et les cellules endothéliales), aujourd’hui la combinaison des traitements donne toute sa signification à l’équation 1+1=3 ! Le gain d’efficacité provient du fait que les médicaments antiangiogéniques peuvent, en effet, bloquer les effets proangiogéniques de la radiothérapie. Ces données permettent également de proposer un schéma d’administration laissé jusque-là à l’arbitraire du praticien. L’administration séquentielle des antiangiogéniques et de la radiothérapie n’offrant que le classique rendement 1+1=2, on peut aujourd’hui recommander d’administrer les antiangiogéniques simultanément à la radiothérapie (ie, dans les heures qui suivent chaque dose de radiations). Ce protocole est particulièrement important pour les médicaments antiangiogéniques à courte demi-vie comme la plupart des petites molécules (« small drugs ») exerçant des effets inhibiteurs de l’activité tyrosine kinase des récepteurs aux différents facteurs de croissance.

Immunothérapie et angiogenèse.

Des travaux réalisés au sein de notre laboratoire ont également révélé que certaines approches antiangiogéniques pouvaient se révéler utiles pour accroître la réponse immunitaire vis-à-vis des tumeurs. Le recrutement lymphocytaire dans les tumeurs implique en effet une étape d’adhérence à l’endothélium des vaisseaux tumoraux, avant la diapédèse ou cheminement du pôle luminal de l’endothélium vers le compartiment tumoral. L’adhérence des lymphocytes est régulée par des molécules d’adhérence qui dans un premier temps freinent les lymphocytes circulants (étape dite de « rolling ») et ensuite les stoppent à la surface de l’endothélium (« docking »). Ce processus est identique à celui observé lors de la réaction inflammatoire où la surexpression des molécules d’adhérence assure le recrutement des leucocytes uniquement sur l’endothélium des vaisseaux irriguant les tissus concernés ; dans les autres tissus, les molécules d’adhérences sont peu abondantes et généralement pas exprimées à la surface membranaire (Figure 3). Nos travaux ont démontré que ces molécules d’adhérence étaient bien présentes en plus grand nombre en réponse à des stimuli inflammatoires tels que ceux rencontrés dans les tumeurs, mais que le VEGF réduisait la capacité de ces molécules à s’agglutiner (« clustering ») et donc prévenait l’adhérence des lymphocytes T (Figure 3) [3]. Nous avons identifié eNOS, l’enzyme produisant le monoxyde d’azote (NO) dans les cellules endothéliales, comme l’effecteur de cette forme d’anergie immunitaire induite par le VEGF. Le NO est, en effet, capable de bloquer la réorganisation du cytosquelette nécessaire au réarrangement des molécules d’adhérence en grappes (« clusters ») nécessaires à la fixation des lymphocytes (voir Figure 3) [3]. 
Nos résultats nous permettent également de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques. En effet, bien qu’inhiber la production de NO présente le risque de réduire le tonus des vaisseaux sains sous la dépendance de ce médiateur, une inhibition sélective au niveau des vaisseaux tumoraux permettrait de favoriser le recrutement des lymphocytes T cytolytiques sans effets indésirables sur la pression sanguine du sujet traité. Nous avons découvert que les effets accrus du NO étaient dus à la réduction de l’expression d’une protéine dénommée cavéoline régulant normalement à la baisse l’activité de la NO synthase endothéliale [4, 5] . Dans une étude préalable, nous avions documenté comment l’administration de nanoparticules constituées de lipides cationiques et d’un minigène codant pour cavéoline pouvait effectivement permettre de restaurer l’expression de taux (supra -) physiologiques de cavéoline spécifiquement dans l’endothélium des vaisseaux tumoraux et bloquer les effets proangiogéniques du NO [6]. A ce jour, nous avons démontré qu’en procédant de la sorte in vitro, l’activation des molécules d’adhérence par leur « agglutination » au sein de la membrane plasmique pouvait être restaurée [3]. À nouveau, ces données indiquent que l’inhibition de l’angiogenèse caractéristique des vaisseaux tumoraux peut potentialiser la réponse à un traitement antitumoral conventionnel.

Hypoxie et résistance des cellules endothéliales.

Notre laboratoire s’est également investi dans la recherche de nouveaux traitements antiangiogéniques. Notre approche trouve son point de départ dans l’observation que les cellules endothéliales sont particulièrement résistantes à l’apoptose et que les traitements antiangiogéniques n’ont chez l’homme jamais l’ampleur ni la rapidité des effets observés chez la souris [1]. Nous avons donc cherché à identifier les caractéristiques du micro-environnement tumoral pouvant justifier le développement de ce phénotype particulièrement résistant des cellules endothéliales des vaisseaux tumoraux. Nous nous sommes progressivement focalisés sur la forme intermittente d’hypoxie qui influence les vaisseaux tumoraux. L’organisation chaotique des vaisseaux tumoraux sans la hiérarchie qui caractérise l’arbre vasculaire des tissus sains (ie, le réseau artérioveineux séparé par des capillaires) entraîne une perfusion hétérogène de la tumeur. En collaboration avec le laboratoire du Professeur Bernard Gallez qui a développé des outils basés sur la résonance magnétique, nous avons pu établir que des anomalies temporelles et locales de perfusion étaient responsables à leur tour d’hétérogénéités dans l’oxygénation de la tumeur [7] (Figure 4). 
Le point critique du paradigme de l’hypoxie intermittente est que les vaisseaux tumoraux sont également exposés à l’hypoxie suite à ces interruptions cycliques du flux sanguin et donc du contact avec les globules rouges transporteurs d’oxygène. L’hypoxie était jusqu’ici l’apanage des cellules tumorales localisées à une distance supérieure à celle de la diffusion de l’oxygène ; on dénomme d’ailleurs également cette hypoxie classique, « hypoxie de diffusion ». L’hypoxie intermittente, encore baptisée « hypoxie de perfusion »,  élargit le concept d’hypoxie tumorale. Nous avons pu démontrer que l’influence conjointe des périodes d’hypoxie (profonde) et de réoxygénation (modérée) sur les cellules endothéliales leur conférait effectivement une capacité accrue de résistance vis-à-vis de stress proapoptotiques tel que la radio- et la chimiothérapie, mais également les traitements antiangiogéniques [8]. Des données récentes (non publiées) nous ont permis d’identifier les périodes de réoxygénation (ou de moindre hypoxie) comme un stimulus puissant de la protéine kinase Akt, une protéine impliquée dans de nombreux processus de survie cellulaire. De façon inattendue, l’activation d’Akt pendant les phases de réoxygénation est responsable d’une potentialisation des effets médiés par le facteur transcriptionnel HIF-1 pendant les phases d’hypoxie. Ce facteur actif sous forme d’un dimère (HIF-1alpha, l’un des deux partenaires n’est stabilisé qu’en conditions hypoxiques) est ainsi d’autant plus exprimé que la phase d’hypoxie est précédée d’une courte période de réoxygénation. Nous avons également montré comment des petits ARN d’interférence dirigés contre HIF-1alpha [8] ou un inhibiteur pharmacologique de la voie Akt dépendante pouvaient effectivement restaurer la sensibilité des cellules endothéliales à l’apoptose. Différents médicaments ciblant HIF-1alpha ou Akt sont en développement pour bloquer leurs effets dans les cellules tumorales. Notre étude démontre qu’ils trouveront également une application en soutien des traitements antiangiogéniques.
Notre travail a également identifié une cible plus en amont à l’origine d’une partie des hétérogénéités de perfusion dans la tumeur. Nous avons, en collaboration avec le Prof. Chantal Dessy (pôle cardiovasculaire de l’Unité de Pharmacothérapie), pu développer une méthodologie d’isolement de microvaisseaux tumoraux par microdissection. Leur montage dans des myographes a permis d’étudier les déterminants du tonus de ces vaisseaux. À notre grande surprise, alors que de nombreux ouvrages de référence rapportent un état de vasodilatation exacerbé des vaisseaux tumoraux, nous avons pu démontrer qu’une proportion de ces vaisseaux présente un tonus dit myogénique en raison des quantités supraphysiologiques d’endothéline produite par la tumeur [9]. Cette cytokine est décrite comme une substance proangiogénique en oncologie médicale mais comme un puissant vasoconstricteur par les spécialistes du système cardiovasculaire. La double orientation de notre laboratoire, système cardiovasculaire et oncologie, nous a permis de supprimer cette frontière artificielle et de documenter que l’administration d’un antagoniste de l’endothéline pouvait de façon spécifique induire une augmentation du diamètre de nombreux vaisseaux tumoraux [9]. Les concentrations élevées d’endothéline dans les tumeurs rendent sélectifs les effets de faibles doses d’antagonistes de l’endothéline, qui sont donc dénués d’effets indésirables comme l’hypertension. Les conséquences sont un gommage des hétérogénéités de perfusion à l’origine de l’hypoxie intermittente, avec des vaisseaux, et en particulier des cellules endothéliales, moins résistant(e)s aux traitements antiangiogéniques [7, 8]. De façon intéressante, nos travaux démontrent que l’hypoxie intermittente a également un impact protecteur sur les cellules tumorales [8], identifiant par là même une nouvelle voie de sensibilisation aux traitements cytotoxiques conventionnels.
En résumé, dans cette partie de notre travail, nous avons identifié la résistance accrue des cellules endothéliales en réponse à l’exposition à l’hypoxie intermittente (caractéristique de nombreuses tumeurs) mais également les moyens pharmacologiques capables de corriger les hétérogénéités de flux à l’origine de ces altérations phénotypiques. Ces travaux sont publiés et des essais cliniques devraient suivre de façon à dans un premier temps valider les effets d’antagonistes de l’endothéline, et lorsqu’ils seront disponibles, tester les inhibiteurs de HIF-1alpha en combinaison avec les médicaments antiangiogéniques.

Conclusions.

L’expression « from bench to bedside and return » (de la paillasse au lit du patient et inversement) s’est imposée à la thématique des traitements antiangiogéniques. Après les espoirs fous nés de résultats saisissants chez la souris (un prix Nobel prédisait en 1998 la fin du cancer pour l’an 2000 !) et les échecs des premières molécules testés chez les patients, la communauté scientifique a su se remettre en question. La recherche fondamentale et translationnelle apporte chaque jour son lot d’amendements dans l’utilisation optimale des drogues antiangiogéniques aujourd’hui à notre disposition. Avec le développement de nouvelles drogues et une sélection plus appropriée des patients auxquels ces médicaments sont proposés, il est certain que de plus en plus de traitements antiangiogéniques viendront rejoindre l’armentarium des stratégies thérapeutiques antitumorales. Notre laboratoire oeuvre à contribuer à ce que de nouvelles stratégies antiangiogéniques soient identifiées, mais surtout à ce que ce type d’approche soit exploitée de manière efficace en association avec d’autres stratégies [1, 10], sachant qu’à ce jour et pour de nombreux types de cancers, la combinaison des modalités de traitements reste la voie privilégiée pour la survie à long terme du patient.

 
Remerciements.

Les principaux acteurs des résultats présentés ici apparaissent comme 1er auteurs des papiers cités en annexe. Leur financement et les subsides nécessaires au fonctionnement trouvent leur source auprès des fonds suivants : FNRS, Télévie, Fondation J. Maisin, Fondation contre le cancer, Centre du Cancer-UCL, et Communauté française de Belgique (ARC).

Références.

1. Feron O. Targeting the tumor vascular compartment to improve conventional cancer therapy. Trends Pharmacol Sci. 2004 Oct;25(10):536-42. Review.
2. Sonveaux P, Brouet A, Havaux X, Gregoire V, Dessy C, Balligand JL, Feron O.  Irradiation-induced angiogenesis through the up-regulation of the nitric oxide pathway: implications for tumor radiotherapy. Cancer Res. 2003 Mar 1;63(5):1012-9.
3. Bouzin C, Brouet A, De Vriese J, Dewever J, Feron O. Effects of vascular endothelial growth factor on the lymphocyte-endothelium interactions: identification of caveolin-1 and nitric oxide as control points of endothelial cell anergy. J Immunol. 2007 Feb 1;178(3):1505-11.
4. Sonveaux P, Martinive P, DeWever J, Batova Z, Daneau G, Pelat M, Ghisdal P, Gregoire V, Dessy C, Balligand JL, Feron O. Caveolin-1 expression is critical for vascular endothelial growth factor-induced ischemic hindlimb collateralization and nitric oxide-mediated angiogenesis. Circ Res. 2004 Jul 23;95(2):154-61. 
5. DeWever J, Frérart F, Bouzin C, Baudelet C, Ansiaux R, Sonveaux P, Gallez B, Dessy C and Feron O. Caveolin-1 is critical for the maturation of tumor blood vessels through the regulation of both endothelial tube formation and mural cell recruitment. Am J Pathol 2007, in press.
6. Brouet A, DeWever J, Martinive P, Havaux X, Bouzin C, Sonveaux P, Feron O. Antitumor effects of in vivo caveolin gene delivery are associated with the inhibition of the proangiogenic and vasodilatory effects of nitric oxide. FASEB J. 2005 Apr;19(6):602-4. 
7. Martinive P, De Wever J, Bouzin C, Baudelet C, Sonveaux P, Gregoire V, Gallez B, Feron O. Reversal of temporal and spatial heterogeneities in tumor perfusion identifies the tumor vascular tone as a tunable variable to improve drug delivery. Mol Cancer Ther. 2006 Jun;5(6):1620-7. 
8. Martinive P, Defresne F, Bouzin C, Saliez J, Lair F, Gregoire V, Michiels C, Dessy C, Feron O. Preconditioning of the tumor vasculature and tumor cells by intermittent hypoxia: implications for anticancer therapies. Cancer Res. 2006 Dec 15;66(24):11736-44.
9. Sonveaux P, Dessy C, Martinive P, Havaux X, Jordan BF, Gallez B, Gregoire V, Balligand JL, Feron O. Endothelin-1 is a critical mediator of myogenic tone in tumor arterioles: implications for cancer treatment. Cancer Res. 2004 May 1;64(9):3209-14.
10. Bouzin C, Feron O.Targeting tumor stroma and exploiting mature tumor vasculature to improve anti-cancer drug delivery. Drug Resist Updat. 2007, in press. Review.



 
Légendes des figures.

Figure 1. Vue d’un îlot de cellules tumorales avec en son centre un vaisseau sanguin. Les noyaux des cellules tumorales sont marqués en bleu et la protéine endothéliale CD31 est immunorévélée en rouge brun. Au-delà de la distance de diffusion de l’oxygène (~100 µm), la nécrose des cellules tumorale est aisément discernable.

Figure 2. Schéma de la réponse d’une tumeur à la radiothérapie. (1) Avant le traitement, les cellules tumorales sont irriguées via des vaisseaux sanguins néoformés. (2) La radiothérapie exerce ses effets délétères sur les cellules tumorales et les cellules vasculaires. (3) Les cellules endothéliales survivant à la radiothérapie présentent une capacité exacerbée à se réorganiser en capillaires et les cellules tumorales survivantes produisent des taux accrus de facteurs de croissance tels que le VEGF (plage grisée). (4) Un nouveau réseau vasculaire s’est formé facilitant la re-croissance tumorale postradique.

Figure 3. Schéma de la distribution des molécules d’adhérence, dans un vaisseau sanguin sain (A), dans un vaisseau tumoral « angiogénique » sous l’influence du VEGF (B) et dans un vaisseau tumoral exposé aux effets antiangiogéniques d’un inhibiteur pharmacologique ou génétique (ie, plasmide d’expression de cavéoline) de la NO synthase endothéliale (C). En insert sur la droite, les images correspondantes issues de la microscopie confocale : les molécules d’adhérence à la surface d’une cellule endothéliale apparaissent en blanc. À noter, en C. l’agrégation des molécules d’adhérence en grappes (« clusters ») et donc leur « activation » uniquement après exposition au traitement antiangiogénique.

Figure 4. Image histochimique représentative de la densité vasculaire (rouge, CD31), de la perfusion (bleu, Hoechst 33342) et de l’hypoxie (vert, pimonidazole) dans un mélanome chez la souris. À noter, la présence de vaisseaux perfusés (rouge entouré de bleu) et non perfusés (rouge mais pas bleu), ces derniers se retrouvent dans les régions hypoxiques (vertes) de la tumeur (cfr pointes de flèche blanches). L’utilisation de différents marqueurs de l’hypoxie (pas montré ici) permet de démontrer que la perfusion est en fait intermittente, exposant de façon cyclique les cellules vasculaires à l’hypoxie.





 

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