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Newsletter 11

Editorial : Coup d’œil sur quelques programmes de recherche en cours à l’UCL

Les statistiques épidémiologiques restent tristement éloquentes et illustrent plus que jamais l’impérieux besoin de poursuivre et d’amplifier les efforts de recherche en cancérologie. Les chiffres les plus récents témoignent d’une funeste deuxième place des cancers, juste après les maladies cardiaques, comme cause de mortalité aux USA. De 1991 à 2006 le taux de mortalité par 100.000 individus a diminué de 36 % pour les maladies cardiaques et seulement de 16 % pour les cancers (1).

C’est pourquoi à nouveau, après les numéros 3 et 4 de la news consacrés à la recherche, nous faisons un tour d’horizon non exhaustif des activités de nos équipes.

 

Pour nombre de ces programmes, ce qui frappe, c’est la nécessaire association de plusieurs savoirs et technologies : biologie, physique, informatique, métiers de l’ingénieur, télécommunication… pour aboutir aux résultats espérés. Le médecin trouve une place utile, voire indispensable, dans ce concert. Mais nous ne pouvons le dire aussi bien que Monsieur Christian de Duve à qui nous cédons la parole.

 

1) US  Mortality Data, National Center for Health Statistics, Center for Disease Control and Prevention, 2009

Editorial : La recherche a besoin de médecins

Traditionnellement, la recherche que l'on appelle aujourd'hui « biomédicale » était accomplie par des médecins, dont beaucoup continuaient à pratiquer leur métier. Les fondateurs de la physiologie, que Claude Bernard appelait la « médecine expérimentale », de la biochimie, dénommée « chimie physiologique » à l'époque, et de la microbiologie, connue d'abord sous le nom de « bactériologie », étaient tous médecins. Louis Pasteur fut une exception célèbre. Personnellement, c'est au cours de mes études de médecine que j'ai trouvé ma vocation de chercheur et tous mes premiers collaborateurs étaient étudiants en médecine lorsqu'ils ont rejoint mon laboratoire.

 

De mon temps, la légèreté des programmes de candidature rendait possible cet apprentissage précoce, souvent le prélude à une carrière de chercheur. Des bourses de voyage accordées par diverses institutions aux auteurs d'un travail accompli au cours des études encourageaient les étudiants à travailler dans un laboratoire de recherche.

 

Pour toutes sortes de raisons, l'étudiant chercheur est une espèce en voie de disparition. En même temps, les laboratoires se peuplent de plus en plus de physiciens, de chimistes et de biologistes qui y viennent accomplir des mémoires de licence ou des thèses de doctorat. Faut-il le regretter ?

 

De toute évidence, la réponse à cette question est non. L'expérience prouve que les bénéficiaires d'une formation scientifique font des chercheurs aussi productifs, sinon plus, que ceux qu'on appelle, sans thèse à l'appui, « docteurs en médecine ». En outre, on ne peut que se réjouir de voir la recherche médicale s'enrichir de l'apport de scientifiques rompus aux disciplines de base, auxquelles, comme je l'ai ressenti moi-même lorsque j'ai décidé d'étudier la chimie après la médecine, les études médicales ne donnent qu'un accès rudimentaire.

 

Mais cela ne veut pas dire que la recherche n'a pas besoin de médecins. Ceux-ci restent indispensables pour toutes les recherches cliniques, ainsi que pour la recherche, dite « translationnelle », qui vise à transposer au lit du malade les découvertes de laboratoire. Même la recherche fondamentale peut bénéficier de la perspective unique offerte par les études de médecine. Plusieurs de mes collaborateurs, dont le regretté Géry Hers, qui a découvert les maladies lysosomiales et construit un pont impressionnant entre le laboratoire et la clinique, ont démontré la fécondité de l'alliance entre recherche et médecine.

 

Sous quelque forme que ce soit, la recherche biomédicale a besoin de médecins. On ne peut que souhaiter que les programmes d'études soient organisés de manière à encourager les étudiants chercheurs. À défaut de ceux-ci, il n'est pas trop tard après l'acquisition d'un diplôme de docteur en médecine pour se lancer dans la recherche. Le succès croissant, aux États-Unis des « MD-PhD Programs » en est la preuve. Que les jeunes médecins le sachent. La recherche a besoin deux. Les laboratoires les attendent.

 

 

Christian de Duve

Progrès récents et nouveaux espoirs en immunothérapie du cancer

Nicolas van Baren1,2, Jean-François Baurain3, Pierre G. Coulie2, Benoît Van den Eynde1,2, Pierre van der Bruggen1,2

1 Ludwig Institute for Cancer Research, Institut de Duve, Université Catholique de Louvain

2 Unité de Génétique cellulaire, Institut de Duve, Université Catholique de Louvain

3 Centre du Cancer, Unité d’Oncologie médicale, Cliniques universitaires Saint-Luc

 

Nicolas.VanBaren@bru.licr.org

 

Peut-on manipuler le système immunitaire pour combattre les tumeurs ? Comme nous allons le voir, c’est théoriquement possible, dans la mesure où il est établi que la plupart des cancers expriment des antigènes qui les distinguent des tissus normaux, et que le système immunitaire des patients cancéreux a le potentiel de reconnaître ces antigènes et de tuer sélectivement les cellules tumorales qui les portent. Cependant, les essais cliniques de vaccination antitumorale se sont révélés globalement peu efficaces jusqu’à présent. En effet, les tumeurs acquièrent au cours de leur progression des mécanismes de résistance aux lymphocytes T. Nous abordons ici plus particulièrement quelques résultats cliniques récents en immunothérapie du cancer, les progrès effectués dans la compréhension de la résistance tumorale, ainsi que les nouvelles stratégies thérapeutiques qui en découlent.

N.B. Les notions de base sur les antigènes tumoraux et les essais cliniques de vaccination ne sont qu’ébauchées ici. Pour plus de détails, le lecteur pourra consulter la Newsletter 3 du Centre du Cancer (juin 2007), disponible à l’adresse http://www.centreducancer.be/fr/show/newsletters/id/4.

 

Les lymphocytes T cytolytiques et les antigènes qu’ils reconnaissent

 

La principale fonction du système immunitaire est la défense de notre organisme contre les agents infectieux. Pour cela, l’immunité met en oeuvre un ensemble complexe de mécanismes cellulaires et moléculaires qui lui permettent de reconnaître des antigènes présents sur les agents pathogènes ou sur les cellules que ces derniers infectent, et d’éliminer ces agents ou ces cellules malades de façon sélective, c’est-à-dire sans léser les tissus normaux infectés. Par exemple, lors d’une maladie virale, l’infection de cellules de l’hôte s’accompagne de la présence de protéines virales dans ces cellules, et entraîne l’apparition à leur surface de peptides dérivés de ces protéines et présentés par des molécules HLA de classe I. Ces complexes antigéniques peptide/HLA peuvent être reconnus par le récepteur T (TCR ou T Cell Receptor) des lymphocytes T cytolytiques (CTL), les principaux effecteurs immunitaires responsables de l’élimination de cellules malades. En plus de cette interaction spécifique TCR-antigène, le contact entre la molécule CD8 présente sur les CTL et la molécule HLA qui présente le peptide antigénique sur la cellule cible est également requis pour induire l’activation du CTL. Celle-ci déclenche le système lytique du CTL, qui va alors tuer la cellule infectée. Le CTL activé par contact avec son antigène produit également des cytokines, comme l’interféron-γ, qui vont potentialiser localement la réponse immunitaire.

 

Les antigènes spécifiques des tumeurs

 

Le cancer est une maladie qui résulte de l’altération séquentielle de plusieurs gènes impliqués dans le contrôle de la prolifération cellulaire et de l’apoptose. Certaines de ces altérations modifient la séquence en acides aminés d’une ou plusieurs protéines. D’autres induisent l’expression de protéines normalement absentes, ou font surexprimer des protéines faiblement exprimées dans des cellules normales. Ces protéines modifiées peuvent être, tout comme les protéines virales, la source de peptides antigéniques permettant aux CTL de distinguer les cellules qui les expriment des cellules normales1.

Le peptide MAGE-3.A1 est un exemple d’antigène tumoral. Identifié par notre équipe au début des années 19902, ce peptide de neuf acides aminés dérive de la protéine MAGE-3, qui est exprimée par de nombreuses tumeurs, en particulier des mélanomes, des carcinomes de la sphère ORL, du poumon, et de la vessie. Elle est absente des tissus normaux, à l’exception des cellules de la lignée germinale, qui ne portent pas de molécules HLA et ne peuvent donc pas exprimer les antigènes MAGE3. Ce peptide est présenté par HLA-A1, et peut être reconnu par des CTL anti-MAGE-3.A1.

 

Les essais cliniques de vaccination avec des antigènes tumoraux

 

Depuis une quinzaine d’années, nous avons mené un programme de vaccination thérapeutique de patients atteints de cancer à un stade avancé, surtout de mélanome. Le but était d’induire des réponses CTL en administrant un vaccin contenant un ou plusieurs antigènes tumoraux au patient, en espérant voir régresser sa tumeur. Nous avons surtout testé des peptides synthétiques comme vaccin, en particulier le peptide MAGE-3.A1. Nous avons également testé la protéine complète MAGE-3 comme vaccin, ainsi qu’un virus recombinant codant pour des antigènes MAGE4. Certains de ces antigènes ont été combinés à des adjuvants immunologiques, pour augmenter la réponse antivaccinale.

Dans l’ensemble, les vaccins que nous avons testés ont été très bien tolérés, les patients ne montrant que peu d’effets secondaires. L’absence de toxicité sévère nous paraît être un avantage déterminant par rapport aux traitements anticancéreux classiques tels que la chimiothérapie et la radiothérapie. Parmi les patients atteints de mélanome métastatique, de 5 à 25 % ont montré une régression significative de leur tumeur. Ces régressions, parfois complètes et durables, ont été observées essentiellement chez des patients dont la maladie était peu avancée et peu agressive au moment du traitement. La fréquence de régression spontanée dans le mélanome métastatique étant estimée à moins de 0,5 %, on peut conclure que ces régressions tumorales sont liées aux vaccinations. Toutefois, un bénéfice clinique réel n’a été obtenu que dans environ 5 % des cas, ce qui est trop peu pour valider l’approche vaccinale comme une thérapie à part entière du mélanome métastatique.

 

La raison vraisemblable qui explique l’échec fréquent des vaccinations

 

Au début de notre programme clinique, nous pensions que le système immunitaire d’un malade cancéreux ignorait les antigènes exprimés par la tumeur, mais qu'un vaccin suffisamment immunogénique pourrait induire de fortes réponses CTL capables de détruire les cellules cancéreuses. Après avoir étudié les réponses antivaccinales et leur effet sur les tumeurs, nous pensons maintenant qu’il en va autrement. Il apparaît clairement que les patients atteints de mélanome métastatique développent spontanément des réponses immunitaires contre certains antigènes tumoraux exprimés par leur tumeur, et ce, avant toute vaccination. Ces lymphocytes antitumoraux se concentrent dans les métastases, mais deviennent incapables d’agir efficacement contre les cellules tumorales, vraisemblablement à cause de mécanismes de résistance acquis par la tumeur au cours de sa progression. Cette résistance pourrait expliquer l’inefficacité de beaucoup de vaccinations.

Chez certains malades, la conséquence d’un vaccin serait qu’un petit nombre de lymphocytes T induits par lui migreraient dans la tumeur et parviendraient, par un mécanisme inconnu, à activer ou réactiver d’autres lymphocytes antitumoraux, permettant à ces derniers de proliférer et de détruire les cellules cancéreuses5.

 

Quelques succès (modestes) des vaccinations thérapeutiques

 

Les rares malades qui dans notre expérience et celle d’autres équipes ont montré une rémission complète et prolongée d’un mélanome métastatique, maladie réputée incurable, sont là pour témoigner que l’approche vaccinale n’est pas dénuée d’intérêt. D’autres résultats cliniques récents soutiennent cet optimisme.

Un consortium de centres académiques américains dirigé par D. Schwartzentruber a présenté au dernier congrès de l’ASCO les résultats d’une étude clinique de phase III randomisée, dans laquelle des malades atteints de mélanome métastatique (n=185) ont reçu soit de l’interleukine-2 à fortes doses associée à un vaccin composé du peptide antigénique gp100.A2 et d’un adjuvant immunologique, le Montanide, soit de l’interleukine-2 seule. Le traitement comprenant le vaccin améliore de façon significative le taux de réponse (22 vs. 10 %) et la survie sans progression (2,9 vs. 1,6 mois). La survie globale n’est pas significativement différente, mais semble améliorée aussi (17,6 vs. 12,8 mois)6. Il s’agit de la première preuve de principe d’efficacité d’un vaccin thérapeutique antitumoral.

Dans le cancer de la prostate métastatique, la firme pharmaceutique Dendreon vient de demander l’autorisation de mise sur le marché de son vaccin antitumoral, le sipuleucel-T, à la Food and Drug Administration, suite à des résultats positifs dans une étude clinique de phase III. Il s’agit d’un vaccin cellulaire autologue, composé de cellules dendritiques obtenues à partir de monocytes sanguins des patients et chargées avec la phosphatase acide prostatique, un antigène tumoral dans l’adénocarcinome prostatique.

Si ces résultats ne sont pas une révolution en thérapeutique oncologique, ils encouragent à poursuivre les recherches pour améliorer les effets des vaccinations.

 

Une première approche pour améliorer l’efficacité antitumorale des vaccinations : vacciner plus tôt en sélectionnant les patients les plus susceptibles de répondre

 

Les mélanomes primaires sont assez souvent le siège de phénomènes de régression tumorale, associée à un infiltrat lymphocytaire. Et il n’est pas rare de diagnostiquer le mélanome à partir d’une métastase sans qu’une tumeur primitive ait été détectée, ce qui suggère la régression complète de celle-ci. Comme indiqué plus haut, les métastases précoces de mélanome, souvent cutanées ou ganglionnaires, peuvent exceptionnellement régresser spontanément, mais peuvent répondre à un vaccin antitumoral. Enfin, les métastases viscérales ne régressent jamais spontanément, et ne répondent quasi jamais au vaccin. La capacité du système immunitaire à contrôler la progression tumorale semble donc diminuer avec celle-ci. Sur base de ces observations, il est tentant de proposer une vaccination à un stade plus précoce de la maladie, c.-à-d. en pratique à des patients venant d’être opérés d’un mélanome primaire ou métastatique régional à haut risque de rechute. Ce qui implique un essai randomisé de phase II ou III portant sur de nombreux malades.

Une telle étude clinique serait plus démonstrative s’il s’avérait possible d’identifier au préalable certains facteurs prédictifs de la réponse au vaccin, afin de sélectionner les patients les plus à même d’en bénéficier. Récemment, nous avons observé, sur un petit nombre de patients atteints de mélanome, vaccinés en rémission après chirurgie, que ceux dont la tumeur primitive était ulcérée avaient une survie sans progression plus longue que les autres. Cette observation est importante, car l’ulcération du mélanome primaire est un facteur reconnu de mauvais pronostic.

Dans le même ordre d’idées, la firme pharmaceutique GlaxoSmithKline Biologicals conduit une vaste étude clinique de phase III randomisée portant sur plus de 2000 patients atteints de cancer du poumon (NSCLC). Après résection de la tumeur, les malades reçoivent ou non un vaccin composé de la protéine MAGE-3 et d’un adjuvant immunologique. Le suivi clinique est associé à des analyses de prélèvements tumoraux visant à identifier des marqueurs biologiques prédictifs de l’effet du vaccin.

Dans ces traitements en situation « adjuvante » après résection tumorale complète, il est clair que l’absence d’effets secondaires des vaccins est un atout important. Si l’une des expérimentations de vaccination adjuvante devait prouver son efficacité, de nombreuses applications de ce type de traitement pourraient alors être développées, dans beaucoup de types de cancer pour lesquels les patients se retrouvent avec une très faible charge tumorale après chirurgie, chimiothérapie ou radiothérapie.

 

 

Une deuxième approche pour améliorer l’efficacité antitumorale des vaccinations : identifier et contrer les mécanismes de résistance tumorale aux CTL

 

De nombreuses équipes de chercheurs s’intéressent à ce point crucial. Beaucoup de mécanismes confèrent aux tumeurs la capacité d’échapper à la destruction par le système immunitaire. Les principaux sont repris dans la Figure 1. Mentionnons que l’environnement tumoral peut produire des facteurs immunosuppresseurs solubles comme le TGF-beta, l’IL-10 ou la galectine-3. Il peut attirer des cellules qui inhibent les lymphocytes T, comme les cellules myéloïdes suppressives ou les lymphocytes T régulateurs. Il peut exprimer l’enzyme indoleamine-2,3-dioxygénase (IDO) qui inhibe les lymphocytes T en déplétant l’environnement en tryptophane. Enfin, des lymphocytes T activés peuvent à la longue être neutralisés suite à l’expression des récepteurs CTLA-4 ou PD-1, qui inhibent les lymphocytes lorsqu’ils fixent leur ligand B7 ou PD-L1.

 

Il faut noter que ces recherches ont été effectuées essentiellement sur des souris ou sur des modèles in vitro, et que leur pertinence pour les tumeurs humaines n’est pas clairement démontrée. Personne ne sait actuellement quels sont les mécanismes moléculaires précis qui permettent aux cellules tumorales humaines de survivre et proliférer en présence d’une réaction immunitaire censée les détruire. L’identification de ces mécanismes pourrait permettre de développer des contre-mesures, lesquelles pourraient alors, en association avec des vaccinations antitumorales, renverser la situation en faveur de l’immunothérapie.

Plusieurs approches sont prometteuses. Deux d’entre elles sont en développement clinique. La première cible la protéine CTLA-4, laquelle bloque l’activation des lymphocytes T, au moyen d’un anticorps monoclonal appelé ipilimumab, développé par la compagnie Medarex. Dans des essais de phases I et II dans le mélanome métastatique, des infusions répétées de cet anticorps induisent des régressions tumorales chez 13 %, 17 % et 22 % des patients traités en association avec respectivement un vaccin antitumoral, la dacarbazine, ou l’interleukine-2. Toutefois, l’anti-CTLA-4 a des effets toxiques, principalement des hypophysites, entérocolites, uvéites, dermatites et insuffisances surrénaliennes. Ces atteintes parfois sévères sont attribuées à une diminution de la tolérance immunitaire par l’anticorps anti-CTLA-4, ce qui réveillerait des lymphocytes T autoréactifs. La seconde approche thérapeutique expérimentale cible la voie inhibitrice PD-L1/PD-1 avec un anticorps anti-PD-1. Les résultats, encore préliminaires, ne semblent pas montrer le même effet antitumoral que l’ipilimumab.

Une autre approche que nous développons au laboratoire, basée sur l’inhibition spécifique de l’enzyme immunosuppressive IDO7, a été décrite précédemment (cfr. Newsletter 3 du Centre du Cancer, juin 2007). Nous décrivons plus en détail ci-après une troisième voie, également en cours de développement dans notre laboratoire, centrée sur la galectine-3.

 

Un nouveau mécanisme de résistance tumorale réversible

 

Plusieurs études indiquent que les lymphocytes infiltrant les tumeurs ne fonctionnent pas correctement. On parle alors d'anergie des lymphocytes T. Notre équipe a récemment mis en évidence un nouveau mécanisme d’anergie (ou épuisement) des lymphocytes T humains, et a découvert des approches pour corriger cette anergie. Nous avons initialement observé que la plupart des CTL, suite à un contact avec des cellules présentant l'antigène, perdent pendant plusieurs jours leur capacité à être activés, à tuer des cellules présentant l'antigène, et à produire de l'interféron-γ. 

Différentes approches expérimentales ont été mises en œuvre pour essayer de comprendre cette anergie. Comme indiqué au début, un CTL a besoin au minimum de deux récepteurs pour reconnaître l'antigène et pour être activé : le TCR et le CD8. Le nouveau microscope confocal récemment acquis par l'Institut de Duve a permis d’observer, en collaboration avec P. Courtoy et P. Van Der Smissen que les deux récepteurs sont proches l'un de l'autre (colocalisés) à la surface des lymphocytes fonctionnels, tandis qu’ils sont distants à la surface des lymphocytes anergiques (Figure 2)8.

 

Pour expliquer l’absence de colocalisation de CD8 et TCR sur les lymphocytes anergiques, nous avons envisagé la possibilité que ces molécules soient retenues à des endroits différents de la membrane. En ce qui concerne le TCR, il semblerait que lorsque les lymphocytes sont mis trop souvent en présence de l'antigène, les TCR se chargent en polysaccharides. Une molécule, appelée galectine-3, se lie alors à ces sucres et retient les TCR qui perdent ainsi leur mobilité et ne peuvent plus interagir avec CD8.

 

Pour tester cette hypothèse d'une absence de mobilité du TCR à la surface des lymphocytes T anergiques, ceux-ci ont été mis en présence d'un sucre qui se lie à la galectine-3, le N-acétyl-lactosamine ou LacNAc. Deux heures de traitement avec du LacNAc ont permis de récupérer une grande partie de la colocalisation du TCR et du CD8. Les lymphocytes T traités au LacNAc ont alors également récupéré leur capacité à produire de l'interféron-γ suite à une stimulation avec l'antigène (Figure 3)8.

 

On trouve de grandes quantités de galectine-3 dans les tumeurs (Figure 4). Il est tentant de penser que, comme pour les lymphocytes T cultivés au laboratoire, les lymphocytes T qui se trouvent dans les tumeurs sont anergiques en raison de cette présence de galectine-3. Grâce à la collaboration des médecins des Cliniques universitaires Saint-Luc, nous avons pu isoler des lymphocytes T humains à partir de tumeurs, et constater que leurs TCR et les CD8 n'étaient pas co-localisés. Ces lymphocytes étaient incapables de produire de l'interféron-γ suite à une stimulation par des cellules tumorales. Il y a donc une corrélation entre l'anergie des lymphocytes infiltrant les tumeurs et l’absence de colocalisation de leurs TCR et CD88.

 

Ce qui est plus important est qu’il s’est avéré possible de réveiller les fonctions des lymphocytes T infiltrant les tumeurs. Après une nuit d'incubation en présence de LacNAc (le sucre qui se lie à la galectine-3), les lymphocytes ont récupéré la colocalisation du TCR et du CD8 et la capacité à produire de l'interféron-γ  (Figure 5)8.

 

Ces résultats obtenus ex vivo nous font penser qu'injecter dans les tumeurs du LacNAc ou d'autres sucres qui se lieraient à la galectine-3, pourrait restaurer au moins temporairement les fonctions des lymphocytes T et créer ainsi des conditions favorables à une réponse antitumorale efficace. Combiné avec des vaccinations thérapeutiques, un traitement intratumoral ou systémique avec ce type de sucres permettrait peut-être d'induire des régressions tumorales chez un plus grand nombre de patients. Nous testons différents types de sucres qui pourraient être injectés chez des patients et les premiers résultats in vitro sont prometteurs. Sur base de ces travaux, nous mettons sur pied un nouvel essai clinique, dans lequel des patients atteints de mélanome métastatique recevront un vaccin peptidique en association avec un polysaccharide naturel qui inhibe la galectine-3 et qui est déjà en cours de développement clinique.

 

Une autre approche d’immunothérapie sans vaccination : le transfert adoptif

 

À la place d’administrer au patient un antigène pour faire réagir ses cellules immunitaires (immunothérapie active), certaines équipes préfèrent administrer les cellules immunitaires en grand nombre, après les avoir isolées à partir de la tumeur ou du sang du patient, et considérablement amplifiées ex vivo. Cette approche de transfert adoptif est souvent associée à un traitement immunosuppresseur préalable, censé dépléter l’organisme en lymphocytes résidents pour faciliter l’amplification in vivo des lymphocytes injectés. Récemment, l’équipe de S. Rosenberg aux États-Unis a montré des résultats très positifs dans le mélanome, puisqu’environ 50 % des patients traités ont une régression tumorale complète ou partielle9. Plus proche de nous, l’équipe de B. Dréno à Nantes a obtenu des résultats tout aussi encourageants10. Il faut toutefois noter que chaque patient traité mobilise des ressources considérables en personnel et matériel, ce qui rend cette approche difficilement exploitable comme traitement standard du mélanome.

 

Conclusions et perspectives

 

Le bilan global des essais cliniques de vaccination thérapeutique dans le cancer apparaît actuellement décevant. Toutefois, les espoirs qui ont été mis dans cette approche thérapeutique se fondaient sur un modèle simpliste, considérant la tumeur et le système immunitaire comme les seules variables importantes. Il apparaît aujourd’hui clairement que l’environnement tumoral joue un rôle clé dans l’interaction entre les cellules cancéreuses et immunitaires. Une meilleure compréhension de cet environnement complexe permet d’entrevoir de nouvelles possibilités d’actions thérapeutiques. L’immunothérapie du cancer n’en est qu’à ses débuts.

 

Bibliographie

 

1.Van den Eynde BJ, van der Bruggen P: T cell-defined tumor antigens. Curr Opin Immunol 9:684-693, 1997

2.van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, et al : A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 254:1643-1647, 1991

3.Chomez P, De Backer O, Bertrand M, et al : An overview of the MAGE gene family with the identification of all human members of the family. Cancer Res 61:5544-5551, 2001

4.van Baren N, Bonnet MC, Dréno B, et al : Tumoral and immunological responses following vaccination of melanoma patients with an ALVAC virus encoding Mage antigens recognized by T cells. J Clin Oncol 23:9008-9021, 2005

5.Boon T, Coulie PG, Van den Eynde BJ, et al: Human T Cell Responses Against Melanoma. Annu Rev Immunol 24:175-208, 2006

6.D. J. Schwartzentruber DL, J. Richards, R. M. Conry, D. Miller, J. Triesman, F. Gailani, L. B. Riley, D. Vena, P. Hwu : A phase III multi-institutional randomized study of immunization with the gp100:209-217(210M) peptide followed by high-dose IL-2 compared with high-dose IL-2 alone in patients with metastatic melanoma (ASCO abstract n°CRA9011). J Clin Oncol 27, 2009

7.Uyttenhove C, Pilotte L, Theate I, et al: Evidence for a tumoral immune resistance mechanism based on tryptophan degradation by indoleamine 2,3-dioxygenase. Nat Med 9:1269-74, 2003

8.Demotte N, Stroobant V, Courtoy PJ, et al: Restoring the association of the T cell receptor with CD8 reverses anergy in human tumor-infiltrating lymphocytes. Immunity 28:414-24, 2008

9.Rosenberg SA, Restifo NP, Yang JC, et al: Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer 8:299-308, 2008

10.Khammari, Nguyen, Pandolfino, et al: Long-term follow-up of patients treated by adoptive transfer of melanoma tumor-infiltrating lymphocytes as adjuvant therapy for stage III melanoma. Cancer Immunol Immunother, 2007

Les mutations du gène JAK1 : d’un modèle cellulaire expérimental à une potentielle approche thérapeutique.

Dr Laurent Knoops1,2 et Jean-Christophe Renauld1

1 : Ludwig Institute for Cancer research, de Duve Insitute, Université Catholique de Louvain

2 : Centre du Cancer. Service d’Hématologie. Cliniques universitaires Saint-Luc

 

Laurent.Knoops@uclouvain.be

 

 

Introduction : La voie JAK-STAT

 

Les cytokines sont des petites protéines de communication qui sont essentielles dans le dialogue mené entre les différentes cellules de l’organisme. Elles sont nécessaires pour le bon fonctionnement du système immunitaire, mais jouent également des rôles importants dans d’autres processus physiologiques comme l’hématopoïèse, c'est-à-dire la production par la moelle osseuse de globules blancs, de globules rouges et de plaquettes sanguines. Une fois sécrétées, elles se lient à leur récepteur sur les cellules cibles. En aval du récepteur, l’ensemble des mécanismes qui mèneront aux modifications de l’activité et de la fonction cellulaire s’appelle la transduction du signal.

 

Les protéines JAK et STAT sont responsables de la transduction du signal pour plus de 50 récepteurs aux cytokines, dont la majorité des interleukines et des interférons. Ces récepteurs sont composés de deux chaînes qui s’associent pour former des hétéro- ou des homodimères. La caractéristique commune à ces récepteurs est de ne pas posséder d’activité enzymatique intrinsèque. Cependant, l’activité tyrosine kinase (transfert d’un groupement phosphate sur la tyrosine de diverses protéines) est essentielle pour initier les mécanismes de transduction du signal. Dès lors, pour être fonctionnels, ces récepteurs vont s’associer de manière spécifique à d’autres protéines, appelées JAKs, qui sont capables d’exercer cette activité enzymatique de tyrosine kinase.

 

La liaison de la cytokine à son récepteur entraînera une modification conformationelle du complexe qui rapprochera les JAKs et permettra leur activation réciproque. Ces JAKs, ainsi activées, vont phosphoryler des tyrosines dans la partie intracellulaire du récepteur. Ces phospho-tyrosines serviront de point d’ancrage à des protéines appelées les STATs. Les STATs, recrutées par le récepteur activé, vont à leur tour être phosphorylées puis migreront vers le noyau pour induire la transcription d’une série de gènes impliqués dans la réponse aux cytokines (voir Figure 1). C’est cette cascade de réactions biochimiques induite par la fixation d’une cytokine à son récepteur que l’on appelle « la voie JAK-STAT ». Étant donné qu’il n’existe que 4 protéines dans la famille des JAKs (JAK1, JAK2, JAK3 et Tyk2) pour plusieurs dizaines de récepteurs de cytokines, leur liaison est partagée par plusieurs chaînes de récepteurs. Tout comme les JAKs, il n’existe qu’un nombre limité de STATs (STAT1 à STAT6), qui seront spécifiquement activées par différents types de récepteurs.

 

La possible implication de la dérégulation de la voie JAK-STAT dans les cancers a été suspectée lorsqu’une équipe américaine a montré en 1995 qu’une mutation dans le gène JAK de la mouche drosophile, appelée hopscotch, induisait une leucémie chez cet insecte. Cette implication a été confirmée dix ans plus tard chez l’homme par la découverte de la mutation V617F de JAK2 dans les syndromes myéloprolifératifs. Cette mutation entraîne l’activation exagérée de récepteurs qui lient JAK2, comme le récepteur à l’érythropoïétine ou à la thrombopoïétine, et explique le taux élevé de globules rouges ou de plaquettes sanguines observé chez ces patients. Les travaux de notre laboratoire ont consisté à mettre en évidence d’autres mécanismes responsables de l‘activation exagérée de la voie JAK-STAT dans la transformation tumorale.

 

 

Mise au point d’un modèle de transformation tumorale expérimental impliquant JAK1.

 

L’interleukine-9 (IL-9) est une cytokine qui a été découverte dans notre laboratoire il y a presque 20 ans. Elle est essentiellement sécrétée par un sous-type de lymphocyte T, les lymphocytes T CD4+ (T helper) de type 2 (TH2), qui sont des lymphocytes impliqués dans la défense contre les infections parasitaires. La sécrétion inappropriée des cytokines TH2 provoque les réactions allergiques, et l’IL-9 joue d’ailleurs un rôle néfaste dans l’asthme.

 

Le récepteur de l’IL-9 fait partie d’une famille de récepteurs composés de deux chaînes : une chaîne spécifique, la chaîne alpha, et une chaîne commune gamma. Cette chaîne commune est partagée avec les autres récepteurs de cette famille, comme les récepteurs de l’IL-2, 4 et -7. Les chaînes spécifiques alpha se lient à JAK1, tandis que la chaîne gamma se lie à JAK3. Ces récepteurs sont essentiellement exprimés dans les lymphocytes T et leurs précurseurs, et activent STAT3, STAT5 et/ou STAT6. Ils régulent la différenciation, la prolifération et la fonction des lymphocytes T (1).

 

Nos travaux sur le fonctionnement du récepteur de l’IL-9 nous ont amenés à mettre au point au laboratoire un modèle de transformation tumorale in vitro, dans des boîtes de culture, basé sur les cellules BAF3 (2). La lignée cellulaire BaF3 ne peut pas proliférer sans cytokine, et meurt en l’absence de facteurs de croissance dans son milieu de culture. Par contre, si on les stimule avec de l’IL-3, on observe une activation de la voie JAK-STAT et BaF3 prolifère. Nous avons introduit un récepteur de l’IL-9 modifié dans ces cellules (mutation phe116). Ce récepteur modifié ne permet pas une réponse optimale à l’IL-9 et les cellules BaF3 meurent pour la plupart. Cependant, en cultivant longtemps ces cellules en présence d’IL-9, nous avons pu sélectionner des lignées BaF3 capables de proliférer. L’acquisition de cette « hypersensibilité » à l’IL-9 constitue une première étape de transformation tumorale. La principale caractéristique de ces cellules hypersensibles à l’IL-9 est qu’elles peuvent donner lieu, après une seconde étape de sélection sans cytokines, à des cellules qui prolifèrent de manière autonome, et qui possèdent une activation constitutive de la voie JAK-STAT. Ces cellules sont tumorales, car elles induisent un cancer lorsqu’elles sont injectées à une souris, contrairement aux cellules BaF3 parentales. Cette prolifération cellulaire anarchique, sans présence de facteurs de croissance, est une caractéristique de beaucoup de cellules cancéreuses.

 

Pour comprendre les mécanismes qui ont mené à la transformation tumorale, nous avons comparé les cellules autonomes tumorales aux cellules parentales. En utilisant la technique des microarrays, une technique qui permet d’avoir une idée du degré d’expression de l’ensemble des gènes (nous en possédons environ 30 000, comme la souris), nous avons pu démontrer que la première étape de transformation était due à la surexpression du gène JAK1 (3). Cette surexpression permet d’expliquer la meilleure réponse à l’IL-9 observée après notre première étape de sélection. En séquençant JAK1, nous avons découvert que la deuxième étape de transformation était liée à des mutations dans JAK1. Nous avons caractérisé 18 mutations différentes capables d’activer JAK1, qui peuvent survenir spontanément et donnent aux cellules qui les ont subies un avantage sélectif pour leur croissance. Ces observations suggèrent donc que la surexpression de JAK1 coopère avec des mutations activatrices pour induire l’activation constitutive des voies de transduction du signal et la transformation tumorale. La prochaine étape était de savoir si ces observations étaient relevantes pour les cancers survenant chez l’homme.

 

 

Les mutations dans JAK1 dans les leucémies aiguës lymphoblastiques.

 

Les leucémies aiguës lymphoblastiques (LLA) sont causées par la prolifération anormale de précurseurs de lymphocytes B ou de lymphocytes T. Ces leucémies sont les cancers les plus fréquents chez l’enfant, et entraînent inévitablement le décès des patients si elles ne sont pas traitées adéquatement. Le traitement chimiothérapique est relativement efficace chez les enfants, mais la majorité des adultes risquent de rechuter de leur maladie.

Un groupe italien a, de manière systématique, séquencé le gène JAK1 dans des échantillons de LLA. Ils ont découvert qu’environ 20 % des LLA adultes possédaient des mutations dans JAK1, analogues aux mutations retrouvées dans notre modèle cellulaire BaF3 (4). En collaborant avec ce groupe, nous avons pu montrer que ces mutations étaient capables d’entraîner l’activation constitutive de la voie JAK-STAT en se liant à certains récepteurs, comme le récepteur à l’IL-9 (5). Ces mutations entraînaient également une résistance aux corticoïdes, une des chimiothérapies utilisées pour traiter la LLA. Ces découvertes démontrent que notre modèle de tumorigenèse in vitro basé sur les cellules BAF3 est relevant pour la cancérologie humaine.

 

 

L’intérêt thérapeutique des inhibiteurs des JAKs et des interferons :

 

La cancérologie moderne évolue vers le développement de traitements ciblant spécifiquement les cellules tumorales, sans atteindre le reste de l’organisme. Pour atteindre un tel objectif, il est essentiel de comprendre les mécanismes qui mènent à la transformation tumorale.

Nous avons vu que les mutations dans JAK1 entraînent l’activation constitutive de la voie JAK-STAT et la prolifération tumorale autonome. Il est donc logique de penser que des molécules capables d’inhiber JAK1 pourraient être efficaces chez des patients leucémiques porteurs de mutations dans JAK1. Pour tester cette hypothèse, nous avons traité nos clones BAF3 autonomes par des inhibiteurs de JAKs.  Ce traitement a entraîné la mort de toutes les cellules BAF3 mutées dans JAK1. Cette observation suggère que les inhibiteurs des JAKs, qui commencent à être disponibles en clinique pour le traitement des syndromes myéloprolifératifs (6), sont de bons candidats pour cibler les cellules leucémiques portant des mutations de JAK1.

Nous savons également que JAK1 est liée à d’autres familles de récepteurs, comme le récepteur aux interférons-a et –ß (Figure 3). Les interférons-a et -ß sont des cytokines antivirales et antiprolifératives qui sont utilisées en clinique pour le traitement des hépatites virales, de la sclérose en plaques ou des syndromes myéloprolifératifs. Nous avons observé que les leucémies portant une mutation dans JAK1 sont caractérisées par une activation des voies de transduction du signal en aval du récepteur aux interférons. Cette activation, qui est également présente dans nos cellules BAF3 mutées dans JAK1, est liée à l’activation du récepteur aux interférons par JAK1. Elle est trop peu importante que pour inhiber la prolifération cellulaire. Cependant, lorsque l’on stimule les cellules avec de l’interféron -a, les cellules mutées dans JAK1 répondent de manière exagérée aux interférons, contrairement aux cellules parentales, et leur prolifération est complètement inhibée. Les mutations dans JAK1 ont donc un effet paradoxal sur la prolifération cellulaire : elles stimulent la prolifération, mais rendent les cellules hypersensibles à l’effet antiprolifératif de l’interféron. Les interférons-a et -ß pourraient donc être utilisés en clinique comme traitement adjuvant des LLA mutées dans JAK1 (7).

Advances and Challenges in the Field of Myeloproliferative Neoplasms

Pr. Stefan N. Constantinescu

Ludwig Institute for Cancer research, de Duve Insitute, Université Catholique de Louvain

 

stefan.constantinescu@bru.licr.org

 

 

Over the past four years, the Philadelphia chromosome-negative myeloproliferative neoplasms (MPNs) have seen major progress - the identification of the unique acquired somatic V617F mutation in JAK2 (Janus kinase 2) in >95% of Polycythemia Vera (PV) and >50% of Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF) patients, the discovery of activating mutations in the thrombopoietin receptor (TpoR, c-Mpl) in 2-8% of  non-PV MPN patients negative  JAK2 V617F, and the commencement of clinical trials with JAK2 inhibitors for myelofibrosis patients (1). Worldwide, the detection of JAK2 V617F (Figure 1) has become as common as the assessment of the BCR-ABL fusion product for chronic myeloid leukemia. The 2-3% of PV patients that do not harbor JAK2 V617F were subsequently identified to harbor mutations in exon 12 of JAK2 (V617F is in exon 14), in a region around K539 (2). These mutations cluster in space close to V617F in the pseudokinase domain of JAK2. Overall, it has become clear that blocking JAK2 emerged as a major goal for therapy in MPNs, as all available evidence argue for a general dysfunction of the JAK2-STAT5/STAT3 pathway in MPNs.

 

Mechanisms of disease

 

Formation of red blood cells, platelets and granulocytes requires the presence of cytokines, such as erythropoietin (Epo) (Figure 2), thrombopoietin (Tpo) and Granulocyte-Colony-Stimulating Factor (G-CSF), which bind to their specific receptors, EpoR, TpoR and G-CSFR, leading to survival, proliferation and differentiation of precursors into mature blood cells. The three receptors, erythropoietin receptor (EpoR), thrombopoietin receptor (TpoR) and the Granulocyte-Colony-Stimulating Factor receptor (G-CSFR) utilize a Janus tyrosine kinase family member, JAK2, for signaling (Figures 1 and 2). Janus kinases are tyrosine kinases that bind to the cytosolic tails of cytokine receptors, and become activated when receptors are activated by ligand binding to the extracellular domains (Figure 2). They are absolutely required for signal transduction by more than 30 cytokines, as they phosphorylate downstream targets that mediate survival, proliferation and differentiation of myeloid progenitors.

 

The hallmark of MPNs is represented by cytokine-independent formation of myeloid blood cells, such as erythrocytes in PV and platelets in ET and certain cases of PMF (3). Mutations of JAK2, such as the very prevalent V617F mutation (Figure 2), constitutively activate the JAK2 molecule, especially in complex with cytokine receptors, such as EpoR, TpoR or G-CSFR (4, 5). In this situation, precursors of erythroid cells no longer need the Epo signal to stimulate red blood cell formation, and excessive numbers of red blood cells are formed. The same goes for TpoR and G-CSFR. For mutants of TpoR, such as TpoR W515L/K/A, the TpoR-JAK2 complex signals in the absence of Tpo and induces hyperproliferation of megakaryocytes (6-8). It is therefore easy to imagine that mutations in JAK2 will activate, in the absence of cytokines, survival, proliferation and differentiation of myeloid progenitors.

 

How can we then explain why one acquired somatic mutation, JAK2 V617F, can induce three diseases, PV, ET and PMF? In other words, why do not all patients expand the three lineages, with some preferentially expanding the erythroid and other the megakaryocyte lineages, while some develop fibrosis of the marrow due to pro-fibrotic factors secreted by hyperproliferation of disease megakaryocytic and granulocytic progenitors?

 

The answer to this question is not known. Several hypotheses are being tested in several laboratories: i) the subtype of hematopoietic stem cell (HSC) where a JAK2 mutation first arises (Figure 3) may already be biased towards one or the other myeloid lineages, thus the phenotype will depend on the initial bias of the particular mutated HSC; (ii) genetic variation between individuals may favor activation by JAK2 V617F of one or the other of the receptors, i.e. EpoR versus TpoR; (iii) gene dosage, which translated eventually into the amount of active JAK2 V617F kinase may influence phenotype; for example, in transgenic mice low JAK2 V617F levels are associated with ET, high levels with PV and very high levels with PMF (9). This model is attractive, but it is hard to understand how we can transpose the situation of mice where by transgenesis the JAK2 V617F can be set at 1:6 of the wild type JAK2, when in patients we can have heterozygous (1:1) or homozygous JAK2 V617F genotypes. It is true that in certain PV patients the mutated gene is not only copied in the place of the normal one (mitotic recombination), but it also becomes overexpressed. We noted that co-expression of JAK2 V617F and TpoR in hematopoietic cell lines leads to down-modulation of TpoR at high JAK2 V617F levels, a phenomenon that resembles that of PV and PMF patients described by Jerry Spivak's group to down-modulate TpoR expression in megakaryocytes (10). This might help explain why, at levels of JAK2 V617F above a certain threshold, EpoR will be fully active in complex with JAK2 V617F to stimulate red blood cell formation, while TpoR will not, hence not all PV patients will have ET. Why a fraction of PV and ET patients evolve to myelofibrosis is not known; which factors determine evolution of these three diseases to leukemia is equally not known.

 

MPNs and leukemia

 

Discovery of JAK2 V617F sparked interest in searching for the role of the mutation in the evolution of ET, PV and PMF towards acute myeloid leukemia. 5-20% of PMF and a small percentage   of PV and ET can evolve to acute myeloid leukemia (AML), a leukemic condition that is refractory to treatment. In that sense, the AML post PV/ET/PMF is much more severe than the blast crisis of CML.

 

The expectation was that the blasts of AML post JAK2 V617F-positive MPN to be positive for JAK2 V617F. Surprisingly, 40-50% of the AML in MPN patients with JAK2 V617F are negative for JAK2 V617F (11, 12). This is not due to mitotic recombination in the reverse sense (unmutated gene replacing the mutated gene). Possible explanation of this phenomenon could be: i) the existence of a pre-JAK2 V617F lesion that predisposes to transformation (13); ii) transformation of a different blood progenitor by the cytokine storm induced by the MPN; iii) a transforming effect of previous cytostatic treatment for MPNs or other simultaneous cancer conditions in the patients. Work performed in BCR-ABL-positive chronic myeloid leukemia (CML) indicated that AML occurs not by transformation of HSCs (see below for MPNs), but of an early progenitor, such as a CFU-GM-type of progenitor (14) (Figure 3), which becomes immortal and loses the capacity to differentiate; among such blast cells are the famous cancer stem cells, that are at the origin of the transplantable disease, which is AML. If we believe the analogy with AML on CML is valid for MPNs with JAK2 V617F, the question is then, which factors lead to transformation of a JAK2 V617F-positive or JAK2 V617F-negative CFU progenitor?

 

 

Hematopoietic stem cells and MPNs: The question of the mutated stem cells

 

Both the BCR-ABL negative and positive (CML, chronic myeloid leukemia) are known to be due to acquisition of mutations at the HSC level (Figure 3). The reasons for the acquisition of the mutation are unknown. Transplantation of mutated and non-mutated HSCs from MPN patients showed that apparently the mutated HSCs do not exhibit a proliferative advantage, and in fact are less able to reconstitute NOD-SCID (immunodeficient) mice than non-mutated HSCs (15). On the other hand, mutated HSCs must acquire some sort of advantage, and we propose that some pressure must be exerted in the marrow of MPN patients that is overcome by the acquisition of JAK2 V617F, TpoR W515L/K/A or BCR-ABL. In ET it has recently been shown that JAK2 V617F is acquired in several different clones, which co-exist with normal clones (16). One key difference between the HSC status in ET and PV versus PMF is that in JAK2 V617F-positive PMF almost only mutated HSCs can be demonstrated to survive in the patients (15).

Given that MPNs are HSC diseases, a curative treatment must not only block the expansion of myeloid progenitors, but must eliminate the mutated HSCs. In BCR-ABL positive CML, it was shown that drugs such as Imatinib, which is extremely efficient to erradicate expansion of the granulocytic compartment, cannot eliminate the mutated HSCs (17), possibly due to: i) the high levels of multidrug resistance protein in HSCs, which can induce the efflux of drug from HSCs; ii) the lack of proliferative advantage of mutated HSCs and thus inhibiting BCR-ABL does not favor the non-mutated HSCs, and iii) the very high level of expression of BCR-ABL in HSCs. As such, the disease relapses (17).

 

The picture is complicated with the recent description of other events than JAK2 V617F in MPNs, events that can either precede or succeed JAK2 V617F. One of such events is represented by biallelic inactivation of TET2, which is a homolog of the gene originally discovered at the chromosome Ten-Eleven Translocation (TET) site in a subset of patients with acute leukemia (18). TET2 was first found in AML patients with deletions of chromosome 4q24 and was suggested to be a tumor suppressor gene. Adoptive transfer experiments of human mutated HSCs into immunodeficient mice indicated that inactivation of both TET2 copies gives a proliferative advantage to HSCs. This advantage is not sufficient to induce disease, but explains clonal expansion at the HSC level. 15-20% of MPNs, AML and myelodysplasia (MDS) patients harbor inactivation of TET2 (18). The molecular basis of the effects of TET2 deletion in HSCs is not known. One clue to the function of TET proteins might come from the discovery that conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in mammalian DNA is catalyzed by the close relative of TET2, namely TET1 (19). Thus, it is possible that members of the TET family play important roles in methylation patterns. TET2 inactivation, along with other events, appear to represent an unsuspected level of heterogeneity of MPNs. Clearly, this heterogeneity has to be taken into account when patients are included in different trials.

 

 

Inhibitors of JAK2 and treatment perspectives

 

Given that a large majority of MPN patients harbor JAK2 mutations, especially JAK2 V617F, at least 7 or 8 small molecule inhibitors of JAK2 have been obtained by several companies and are now in clinical trials against myelofibrosis, and hopefully soon in the treatment of PV (20). The underlining assumption is that anomalies of the JAK-STAT pathway must exist also in JAK2 V617F-negative MPNs. All are ATP-competitive inhibitors, which target the ATP binding pocket of the kinase domain. Since the V617F mutation is in the pseudokinase domain, these inhibitors cannot distinguish between normal and mutated JAK2. However, the expectation is that such inhibitors will inhibit the mutant JAK2 at lower doses, as the constitutive signal is weaker than that of the cytokine-induced signal.

 

More than 1.5 years after the outset of these trials, it has become clear that some of these molecules induce a benefic effect in rapidly reducing spleen size in PMF patients (20). This effect is seen with all molecules, irrespective of their other secondary effects and is independent of the JAK2 V617F status. No lysis is observed after spleen shrinkage, suggesting the effect is based on inhibition of migration of progenitors to the spleen. The mechanism of this effect is unclear, but it appears that JAKs might play an important role in migration of blood progenitors from bone marrow to spleen, possibly by participating in the signaling by chemokine receptors. While spleen reduction is spectacular and benefic, it does not appear that inhibitors of JAK2 can reduce marrow fibrosis (at 1 year), or the allele burden (at least with the several compounds that have been tried first) in JAK2 V617F-positive patients. Furthermore, in some cases inhibitors induced anemia and thrombocytopenia; the former will be welcome in PV.

Therefore, at this moments it looks like that ATP-competitive JAK2 inhibitors are not as efficient in reducing the disease clone as Imatinib is in BCR-ABL-positive CML. Design and isolation of true JAK2 V617F-specific inhibitors is extremely difficult, because no crystal structure exists of JAK2 V617F, and targeting regions other than ATP pockets in kinases has proven very difficult.

 

Another approach to treatment of MPNs is to identify small molecule inhibitors of serine/threonine kinases that in association with a JAK2 inhibitor might show synergic activity (synthetic lethality). Last but not least certain MPN patients respond well to interferon alpha, and more efforts are now put in place to understand the basis of such response.

 

One major concern regards the issue of leukemia in MPNs. If 40-50% of JAK2 V617F positive patients that evolve to leukemia develop JAK2 V617F-negative blasts (11, 12), is it then conceivable that inhibition of the MPN clone, that is for example the JAK2 V617F-positive clone, would favor the expansion of another clone that can transform to leukemia? The results of the present clinical trials with JAK2 inhibitors are awaited with impatience, in order to see whether leukemia transformation in the treated MPN group occurred with similar or different frequency than in the untreated MPN group. Given that MPNs are associated with a cytokine storm, it is possible that blocking the mutated clone will also inhibit secretion of proliferative cytokines, and thus prevent one of the factors that might contribute to transformation.

 

Références

 

1.         W. Vainchenker, A. Dusa, S. N. Constantinescu, Semin Cell Dev Biol 19, 385 (Aug, 2008).

2.         L. M. Scott et al., N Engl J Med 356, 459 (Feb 1, 2007).

3.         J. F. Prchal, A. A. Axelrad, N Engl J Med 290, 1382 (Jun 13, 1974).

4.         C. James et al., Nature 434, 1144 (Apr 28, 2005).

5.         X. Lu et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102, 18962 (Dec 27, 2005).

6.         Y. Pikman et al., PLoS Med 3, e270 (Jul, 2006).

7.         J. Staerk et al., Blood 107, 1864 (Mar 1, 2006).

8.         C. Pecquet et al., Blood In press, doi:10.1182/blood-2008-10-183558. (2009).

9.         R. Tiedt et al., Blood 111, 3931 (Apr 15, 2008).

10.       A. R. Moliterno, W. D. Hankins, J. L. Spivak, N Engl J Med 338, 572 (Feb 26, 1998).

11.       P. J. Campbell et al., Blood 108, 3548 (Nov 15, 2006).

12.       A. Theocharides et al., Blood 110, 375 (Jul 1, 2007).

13.       R. Kralovics et al., Blood 108, 1377 (Aug 15, 2006).

14.       C. H. Jamieson et al., N Engl J Med 351, 657 (Aug 12, 2004).

15.       C. James et al., Blood 112, 2429 (Sep 15, 2008).

16.       J. R. Lambert, T. Everington, D. C. Linch, R. E. Gale, Blood 114, 3018 (Oct 1, 2009).

17.       X. Jiang et al., Leukemia 21, 926 (May, 2007).

18.       F. Delhommeau et al., N Engl J Med 360, 2289 (May 28, 2009).

19.       M. Tahiliani et al., Science 324, 930 (May 15, 2009).

20.       R. A. Mesa, A. Tefferi, Expert Opin Emerg Drugs 14, 471 (Sep, 2009).

 

Résection des sarcomes osseux : comment améliorer la performance chirurgicale ?

Dr Xavier Banse 1, 2, Laurent Paul 2, Olivier Cartiaux 2,3, Dr Pierre Louis Docquier 1, 2, Prof Christian Delloye 1, 2

 

1 Centre du Cancer. Groupe Multidisciplinaire du sarcome. Service de chirurgie orthopédique et de traumatologie. Cliniques universitaires Saint-Luc

2 Centre de recherche CARS (computer assisted and robotic surgery), IREC, UCLouvain

3 Unité CEREM, École polytechnique, UCLouvain.

 

 

Xavier.Banse@uclouvain.be

 

Sarcomes et marge saine

 

Chacun sait qu’à un stade relativement avancé de la maladie, beaucoup de cancers (par exemple, les cancers du sein, de la prostate ou du poumon) métastasent dans les os. Les métastases osseuses sont très fréquentes. Pour les métastases osseuses, le traitement du cancer est en général basé sur l’hormonothérapie, la chimiothérapie ou la radiothérapie. Le chirurgien n’intervient que dans quelques situations, par exemple lorsque l’os menace de casser. Peu de gens savent que certains cancers proviennent directement de tissus du système musculo-squelettique (les os, les tendons, les muscles…). Ces cancers rares sont appelés sarcomes. On distingue les sarcomes des tissus mous (par exemple provenant du muscle) et les sarcomes osseux.

Dans le cas des sarcomes, le chirurgien est fréquemment en première ligne quand il est indispensable de réséquer la tumeur pour traiter le cancer. Cependant, il existe toute une série de stratégies thérapeutiques qui dépendent du diagnostic très précis du type de sarcome, de son extension et de sa localisation. Par exemple, dans certains cas, la chimiothérapie doit précéder et suivre la chirurgie. Dans d’autres, il n’en faut pas. Le Centre du Cancer dispose depuis 2002 d’une équipe pluridisciplinaire, le groupe sarcome. Cinquante nouveaux cas par an sont pris en charge. Dans ce groupe se retrouvent radiologues, anatomopathologistes, radiothérapeutes, oncologues médicaux, pédiatres et chirurgiens spécialisés dans les sarcomes. Pour chaque cas, ils discutent le diagnostic et la stratégie la plus appropriée. Pour les sarcomes osseux, la résection en bloc de la tumeur reste la règle, avec ou sans traitement adjuvant. Le terme « en bloc » signifie que le chirurgien doit laisser autour de la tumeur une couche de tissus sein qu’on appelle la marge saine.

Ne plus amputer

La résection en marge saine pose deux problèmes. D’abord, c’est une chirurgie souvent difficile à réaliser. Il faut passer à distance de la tumeur sans pour autant léser les nerfs ou les artères qui passent à proximité. Durant l’intervention, il est particulièrement difficile de se situer par rapport à la tumeur, et donc de respecter une marge saine. Ensuite, une fois la résection faite, il faut reconstruire le squelette en mettant quelque chose à la place. La reconstruction peut se faire, de nos jours, soit avec des prothèses spéciales, soit avec des greffes osseuses qui viennent littéralement remplacer l’élément retiré. Ces deux difficultés ont longtemps obligé les chirurgiens à amputer le membre. Si l’on peut vivre avec un seul poumon ou un seul rein, c’est plus difficile, vous en conviendrez, avec une seule jambe. Ainsi, la résection-reconstruction est devenue la règle dans la chirurgie des sarcomes et l’amputation est, de nos jours, tout à fait exceptionnelle. Ce progrès remarquable est dû au fait que les chirurgiens orthopédistes disposent aujourd’hui d'implants (prothèses, plaques, vis, clous…), de greffes osseuses, d'outils et de techniques chirurgicales améliorées pour réaliser ce travail. Il est aussi le fait du développement considérable de l’imagerie médicale qui permet de beaucoup mieux délimiter un sarcome. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est particulièrement performante dans ces cas (Figure 1).

Problèmes en salle d’opération

 

Sur les images du scanner ou de l’IRM, le chirurgien peut délimiter la tumeur. Encore faut-il transformer cela en un planning chirurgical précis et veiller à ce que ce plan de bataille soit bien exécuté. C’est-à-dire, passer du virtuel à la réalité. Avec un chirurgien expert dans ce domaine, cela ne pose pas de problème pour certains sites (par exemple le fémur distal, près du genou). Mais, dans les mêmes mains, ce transfert vers la salle d’opération s’est avéré très difficile, en particulier pour les sarcomes dans le bassin osseux (que nous appelons pelvis). La résection et la reconstruction d’un sarcome osseux du pelvis cumulent toute une série de problèmes de telle sorte que l’intervention dure de 7 à 14 heures (Delloye et al. 2007). Le site est particulièrement inaccessible et la forme de l’os extrêmement complexe. Si les marges saines ne sont pas respectées, ou s’il y a effraction de la tumeur, il y a un risque élevé de récidive locale ou de dissémination du cancer. La reconstruction aussi pose problème. Les greffes osseuses sont appelées allogreffes, car elles proviennent d’une autre personne que le patient cancéreux, en général d’un donneur multiorgane. Ici, il s’agit d’un demi-bassin (hemipelvis) qu’il faut découper « sur mesure » durant l’opération de telle sorte que la greffe occupe exactement l’espace laissé libre. Ensuite, il faut la fixer avec des plaques et des vis puis reconstruire l’articulation de la hanche (celle du fémur sur le pelvis). Tout cela a conduit le groupe à solliciter en 2004 et 2007 la Fondation contre le Cancer et le Télévie pour mettre en place un programme de recherche afin de tirer le meilleur parti des technologies disponibles. Leur soutient a été effectif, fidèle et efficace.

 

Confirmation du problème au laboratoire

 

Les chercheurs ont d’abord « reconstitué » en laboratoire. Plusieurs chirurgiens expérimentés ont dû le faire sur des os en plastique (plus exactement en mousse de polyuréthane). Ces modèles couramment utilisés pour l’écolage ont été passés au CT scan et une tumeur a virtuellement été ajoutée. L’expérience a démontré que la précision des chirurgiens était en effet limitée et que la reconstruction était de principe difficile, même dans les conditions idéales du laboratoire (Cartiaux et al. 2008). Pour extraire la tumeur, le chirurgien doit positionner et orienter une lame de scie à l’endroit voulu. La combinaison des plans de coupe détermine le volume réséqué. Il répète la même découpe sur la greffe. En 2006, 2007 et 2009, trois protocoles expérimentaux différents ont démontré que, sans système d’assistance, la précision « à main levée » du chirurgien était de  l’ordre de 10 mm. Il faut savoir que les découpes ont une portée de plusieurs centimètres et que de petites erreurs d'angle (quelques degrés) ont des conséquences significatives. L’équipe a travaillé pour améliorer plusieurs étapes de ces procédures, parfois très en amont de la salle d’opération.

 

Mieux planifier le geste

 

Lors de la préparation d’une telle intervention, le chirurgien va choisir une allogreffe. Ce choix ne dépend que de la forme et de la taille de la greffe. En effet, elle ne risque pas d’être rejetée ; elle peut seulement être mal ajustée. C’est pourquoi la banque d’os de l’UCL dispose de plusieurs greffes en stock. C’est un luxe extraordinaire qui doit, le mieux possible, profiter au patient cancéreux. Le choix de la greffe se fait classiquement en utilisant des radiographies et des calques. Un travail de recherche a permis de démontrer que ce mode de sélection n’était pas optimal (Paul et al. 2008). Depuis  lors, grâce à ce travail, les greffes peuvent être sélectionnées en superposant l’image 3D de l’os du patient avec l’image 3D de la greffe. On utilise le scanner préopératoire du patient et un scanner de toutes les greffes disponibles (Paul et al. 2009). La généralisation de cette procédure à toutes les greffes est en cours à la banque d’os, y compris pour des greffes livrées à l’extérieur des Cliniques universitaires Saint Luc.

 

La greffe choisie, le chirurgien peut choisir l’endroit idéal pour découper l’os en utilisant un outil de planification spécialement adapté. D’abord avec l’aide du radiologue, il délimite sur chaque coupe de l’IRM la tumeur. Le volume tumoral est alors extrait en 3D. Il faut ensuite le transférer vers le CTscan du patient. En effet, si la tumeur se voit bien sur l’IRM le scanner reste souverain pour voir l’os et planifier les découpes. Les chercheurs ont donc adapté un algorithme dit de co-registration pour aligner parfaitement les deux images volumiques d’une modalité (l’IRM) sur l’autre (le CTscan). L’image composite incluant le volume tumoral et le volume osseux est présentée sur le logiciel de planning où le chirurgien peut à son gré déplacer un plan dans l’espace et venir le « déposer » là ou il pense couper l’os (Figure 2, gauche). Le logiciel veille à ce qu’il reste avec une marge saine de, par exemple, 10mm. Plusieurs plans (de 2 à 5) sont planifiés. Il est vite apparu que la manipulation d’un plan avec une souris était presque impossible. Aussi, a-t-elle été remplacée avec succès par un bras haptique (Paul et al. 2009). Il s’agit d’un petit bras articulé qui perçoit les mouvements, la position dans l’espace (Figure 2, droite). L’efficacité de l’outil de planning a été testée par 27 opérateurs différents. Nous l’avons aussi mis en œuvre pour deux patients. Les coordonnées spatiales sont alors transférées sur l’allogreffe. Il ne reste plus qu’à exécuter le planning.

 

Le bon plan

 

Les chercheurs ont été étonnés de constater qu’il n’existait pas de norme reconnue pour mesurer l’alignement correct d’un plan par rapport à ce qui était prévu. Certaines normes ISO (pour International Standard Organization) utilisées largement en mécanique ont dû être adaptées à la chirurgie, puis validées par plusieurs publications pour simplement permettre de mesurer les progrès obtenus (Cartiaux et al, 2009). Maintenant, une erreur de positionnement d’un plan est définie par trois variables d’erreur (et, eb, eg). La norme ISO « localisation » (L) a été acceptée comme résumant efficacement ces trois variables. C’est un outil capital pour mesurer les progrès obtenus. Une fois de plus, ce sont des modèles en plastique qui ont été largement utilisés. Après découpe, les pièces ont été positionnées sur « un marbre » et un outil de palpation a permis de mesurer exactement le résultat du travail du chirurgien (Figure 3).

 

Naviguer la découpe

 

L’industrie a développé des outils permettant de repérer dans la salle d’opération un objet par rapport au patient. Typiquement, c’est un axe qui est repéré, jamais un plan. L’équipe a donc patiemment adapté un de ces outils pour « naviguer » un plan durant l’intervention (Paul, thèse UCL 2009). Jusqu’alors, aucun outil ne permettait de « naviguer » directement un plan (celui de la lame de scie) durant l’intervention. La précision du recalage du pelvis par palpation a été validée et améliorée (Docquier et al. 2009).

L’équipe a ensuite procédé à deux larges expériences pour tester l’efficacité de cette technologie. La première a été faite sur 156  modèles parallélépipédiques (Cartiaux et al, 2010), l’autre sur 54 modèles d’hémipelvis. Dans la première expérience la précision de la découpe a été améliorée de 6 à 3mm. Dans la deuxième, plus réaliste, les opérateurs sont passés d’une erreur moyenne de 10mm à 3 mm. Un progrès remarquable et reproductible (Cartiaux, thèse UCL 2010).

 

Passer en clinique

 

En décembre 2008, l’équipe a pour la première fois appliqué toute la méthode pour garantir la découpe d’une tumeur pelvienne. Ceci avait déjà été tenté par un autre groupe, mais jamais en navigant directement la scie. En janvier 2009, un deuxième patient a été opéré en navigant la découpe, non seulement du patient, mais aussi de la greffe. La combinaison de ces deux étapes était une première mondiale. Pour plus de sécurité, toute l’intervention avait été répétée au laboratoire sur des modèles réalisés par prototypage rapide (Figure 4, droite). Il est possible d’obtenir un modèle 3D de l’os et de la tumeur du patient grâce à des imprimantes 3D. La résection était en marge saine et la reconstruction a rarement été aussi précise au labo comme en salle d’opération.

 

Vers le robot

 

Il est vite apparu que la technique de découpe assistée par ordinateur (voir ci-dessus) avait ses limites. Aussi, l’équipe a demandé à nouveau le soutient de la Fondation contre le Cancer pour acheter, en 2008, un robot industriel anthropomorphe (Figure 5). Nous avons déjà démontré, sur les blocs que la précision d’un tel outil était supérieure à celle de la main de l’homme (Cartiaux et al, 2010). Les résultats préliminaires de l’expérience sur les modèles de pelvis sont prometteurs. Le robot a démontré, sur banc d’essai, qu’il est plus fiable et plus performant qu’un chirurgien expérimenté. Reste à permettre au chirurgien d’apprivoiser ce type d’engin. Ce travail nous occupera probablement durant les 5 ans à venir.

 

Conclusion

 

La mise en œuvre de nouvelles technologies au service du traitement chirurgical du cancer est un travail laborieux. Chaque étape doit être validée patiemment au laboratoire, puis publiée dans des revues internationales pour avancer sur des bases solides. Il s’agit d’un exemple de recherche multidisciplinaire au service des patients atteints de cancers rares et difficiles à traiter. Les premiers patients commencent à bénéficier de cette recherche qui mobilise de moyens importants.

Cryopréservation du tissu ovarien chez des patientes devant bénéficier d’une chimiothérapie

Prof Jacques DONNEZ , Marie-Madeleine DOLMANS, Prof Jean SQUIFFLET, Dr Pascale JADOUL

 

Service de gynécologie, Cliniques universitaires Saint-Luc.

Unité de Recherche GYNE, Banque de Tissu du système reproducteur. Université Catholique de Louvain.

 

Jacques.Donnez@uclouvain.be

 

 

Introduction

 

Dans le domaine oncologique, l’espérance de vie des jeunes patientes atteintes d’un cancer a fortement augmenté. Malheureusement, selon leur agressivité, les traitements chimio- et/ou radiothérapiques peuvent causer une défaillance ovarienne précoce et une perte irréversible de la fertilité, entraînant des effets majeurs sur la qualité de vie à long terme des patientes. En effet, les ovaires sont très sensibles aux effets des traitements cytotoxiques, dont les plus gonadotoxiques sont les agents alkylants (pex. cyclophosphamide, busulfan) (Tableau I). Les dérivés des platines font partie de la catégorie à moyen risque et les agents tels le méthotrexate, le 5-FU et les alcaloïdes sont considérés comme faiblement gonadotoxiques. Le type de chimiothérapie et la dose reçue ainsi que l’âge de la patiente déterminent le risque de ménopause précoce. Celui-ci est bien sûr augmenté en cas d’association à de la radiothérapie, en particulier les irradiations pelviennes et les irradiations corporelles totales (1). Une dose de 5 à 20 Gy administrée aux ovaires est suffisante pour provoquer une ménopause précoce, quel que soit l’âge de la patiente. La dose d’irradiation qui détruit 50 % de la réserve ovocytaire est aussi faible que <2 Gy (2-3).

 

Options permettant de préserver la fertilité chez la femme

 

Plusieurs options permettent de préserver la fertilité chez les patientes dont la population germinale est menacée: la cryopréservation des embryons, la cryopréservation des ovocytes ou la cryopréservation du tissu ovarien (4-7). Le choix dépend de plusieurs paramètres : le type et l’urgence de la chimiothérapie, le type de cancer, l’âge de la patiente et la présence ou non d’un partenaire.

 

La technique de fécondation in vitro avec cryopréservation d’embryons est certes la technique qui doit être envisagée en premier lieu, car elle permet un taux de succès de 30 % dans la pratique courante (patients consultant pour infertilité et non dans le cadre d’un traitement anticancéreux). Néanmoins, elle entraîne bien souvent un délai inacceptable dans le traitement du cancer dû à la stimulation ovarienne. De plus, elle nécessite un partenaire, ce qui n’est souvent pas le cas chez les patientes jeunes.

 

La cryopréservation du cortex ovarien présente l’avantage de pouvoir être appliquée sans délai et ne nécessite pas de recourir à la stimulation ovarienne. Elle peut donc être proposée à des filles prépubères. La congélation de fragments de cortex ovarien permet une bonne survie des follicules primordiaux et leurs ovocytes.

 

 

Greffe de tissu ovarien cryopréservé

 

Afin de permettre la restauration de la fertilité après décongélation du tissu ovarien, deux approches sont envisagées: la greffe de tissu ovarien et la culture de follicules in vitro.

 

L’approche de greffe de tissu cortical en site orthotopique est actuellement la plus prometteuse, car elle permet la restauration d’une fertilité naturelle et une grossesse spontanée (Figure 1).

 

Notre équipe a obtenu en 2004 la toute première naissance après greffe orthotopique de tissu cortical ovarien décongelé chez une patiente après guérison d’un lymphome Hodgkinien. Cette première fut publiée dans le Lancet (8). Une deuxième grossesse évolutive chez une seconde patiente nous permet de placer la Belgique comme pionnière. En effet, en comptabilisant les deux grossesses obtenues à Érasme chez une patiente ayant bénéficié de la technique, la Belgique se classe nettement en tête au niveau mondial dans ce domaine particulier (ces bébés belges venus du froid, le Soir, jeudi 10 décembre 2009).

Lors du premier congrès mondial organisé à Bruxelles par l’ISFP (International Society for Fertility Preservation, décembre 2009), présidé par l’auteur, 11 grossesses avec enfant vivant ont été décrites.

 

Depuis 1996, plus de 350 patientes ont bénéficié d’une cryopréservation ovarienne avant traitement chimiothérapique dans notre service, ce qui fait de la banque de tissu ovarien des Cliniques universitaires Saint-Luc la plus importante du monde.

 

Au sein de notre institution hospitalière, sept réimplantations de tissu ovarien décongelé ont été effectuées chez des patientes ayant eu un traitement par chimiothérapie (Figure 2). Chez toutes ces patientes, la technique de greffe de fragments ovariens a permis la restauration de l’activité ovarienne (Figure 3) avec reprise de la sécrétion hormonale et des cycles menstruels réguliers.

 

Ces résultats prouvent que l’autotransplantation de cortex ovarien cryopréservé est cliniquement applicable. Cependant, avant de proposer cette technique dans la pratique clinique courante, il nous paraît essentiel de poursuivre la recherche expérimentale dans ce domaine afin 1) de maximiser les chances d’obtenir une grossesse spontanée, 2) de développer de nouvelles options pour les indications comportant un risque de métastase ovarienne (telles que leucémies, cancers du sein et de l’ovaire).

 

Afin de proposer le mode de transplantation qui convient le mieux en fonction de chaque situation clinique (type de cancer, risque de transmission, âge), deux options sont étudiées :

La congélation et l’autogreffe de cortex ovarien dont nous venons de démontrer l’applicabilité en clinique.

La cryopréservation et l’autogreffe de follicules isolés évitant le risque de retransmission de cellules malignes via le greffon.

 

Où en est la recherche ?

 

La greffe de fragments

Plusieurs études réalisées sur modèle murin, dont celles de notre laboratoire (9,10), montrent que la greffe de fragments ovariens humains entraîne une perte de 50 à 65 % des follicules primordiaux et de la totalité des follicules en croissance. Cette dégénérescence folliculaire serait liée à l’ischémie consécutive au délai (de 2 à 5 jours) de revascularisation du greffon. Les études récentes ont clairement mis en évidence ces mécanismes de revascularisation des greffons qui permettront de réduire les conséquences délétères de l’hypoxie et de faciliter le processus d’angiogenèse (11-13).

La cinétique et la fonctionnalité des néovaisseaux formés au sein des greffons dans un modèle in vivo de greffe de fragments de tissu ovarien humain ont été récemment établies. Il est apparu qu’un chimérisme vasculaire (jusqu’à présent non décrit) permet par la fusion des vaisseaux du greffon et de l’hôte une néovascularisation qui limite l’hypoxie (11,12). Favoriser ce phénomène en diminuant encore ce délai par l’adjonction d’éléments néoangiogéniques devrait permettre prochainement de réduire l’hypoxie et la perte de follicules au niveau du greffon (12,13).

 

La greffe de follicules isolés, une nouvelle stratégie de greffe ovarienne ? 

La greffe de follicules isolés présente plusieurs avantages par rapport à la greffe tissulaire : 1) il n’y a pas de risque de transmission de cellules malignes dans le greffon (car le follicule primordial est une structure avasculaire protégée par sa membrane basale) 2) la population folliculaire peut être caractérisée avant réimplantation. Les protocoles d’isolement et de récupération folliculaires que nous avons mis au point préservent mieux l’intégrité des follicules humains (14) (Figure 4) et permettent désormais d’envisager le développement de cette technique chez l’humain. Les follicules pourront être regreffés.

La survie et la croissance de follicules ovariens humains après isolement et xénogreffe à des souris nudes (10) ont été démontrées. L’ultrastructure des follicules greffés est bien préservée et certains follicules ont amorcé leur croissance folliculaire après une semaine de greffe. Après 4 mois de greffe, nous avons pu, grâce à une supplémentation en FSH, obtenir des follicules antraux. Ces résultats nous ont encouragés à poursuivre la recherche dans ce domaine. Le défi consiste à présent non seulement à standardiser les techniques d’isolement folliculaire, mais à développer un « ovaire artificiel (scaffold) » qui permettra la greffe de ces follicules isolés en son sein. Un projet de collaboration avec l’ULg (Prof. Foidart), avec le soutien du FNRS-Télévie, de la Fondation contre le cancer et de la Fondation Saint-Luc, devrait nous permettre d’ici peu de mettre au point le matériau idéal (scaffold) pour réaliser un ovaire artificiel.

 

Conclusion

 

En conclusion, grâce aux progrès conjugués dans le domaine de l’oncologie et de la cryopréservation du tissu ovarien, non seulement l’espérance de vie des jeunes patientes devant bénéficier d’une chimiothérapie a augmenté, mais également leur qualité de vie en raison de l’immense espoir de restauration de la fertilité que leur apporte la cryopréservation du tissu ovarien.

 

 

 

Remerciements

Fondation Saint-Luc, Fondation contre le Cancer, FNRS-Télévie.

 

Références

 

  • 1. Donnez J, Martinez-Madrid B, Jadoul P, Van Langendonckt A, Demylle D, Dolmans MM.  Ovarian tissue cryopreservation and transplantation: a review. Hum Reprod Update 2006; 12:519-35.

  • 2. Wallace WH, Thomson AB and Kelsey TW. The radiosensitivity of the human oocyte. Hum Reprod 2003; 18:117-121.

  • 3. Wallace WH, Thomson AB, Saran F and Kelsey TW. Predicting age of ovarian failure after radiation to a field that includes the ovaries. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2005; 62:738-744.

  • 4. Donnez J, Godin PA, Qu J and Nisolle M. Gonadal cryopreservation in the young patient with gynaecological malignancy. Current Op Obstet Gynecol 2000; 12:1-9.

  • 5. Donnez J, Dolmans MM, Martinez-Madrid B, Demylle D and Van Langendonkt A The role of cryopreservation for women prior to treatment of malignancy. Curr Opin Obstet Gynecol 2005; 17:333-338.

  • 6. Torrents E, Boiso I, Barri PN and Veiga A. Applications of ovarian tissue transplantation in experimental biology and medicine. Hum Reprod Update 2003; 9:471-481.

  • 7. Wallace WH, Anderson RA, Irvine DS. Fertility preservation for young patients with cancer: who is at risk and what can be offered? Lancet Oncol 2005; 6: 209-18.

  • 8. Donnez J, Dolmans MM, Demylle D, Jadoul P, Pirard C, Squifflet J, Martinez-Madrid B, Van Langendonckt A. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet 2004; 364:1405-10.

  • 9. Nisolle M, Godin PA, Casanas-Roux F, Qu J, Motta P, Donnez J. Histological and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice. Fertil Steril 2000; 74:122-129.

  • 10. Dolmans MM, Martinez-Madrid B, Gadisseux E, Van Langendonckt A, Camboni A, Coupe A, Donnez J. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction 2007; 134:253-262.

  • 11. Van Eyck AS, Jordan B, Gallez B, Heilier JF, Van Langendonckt A, Donnez J. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertil Steril 2009; 92:374–81.

  • 12. Van Eyck AS, Bouzin C, Feron O, Romeu L, Van Langendonckt A, Donnez J, Dolmans MM. Both host and graft vessels contribute to revascularization of xenografted human ovarian tissue in a murine model. Fertil Steril 2009; [Epub ahead of print].

  • 13. Demeestere I, Simon P, Emiliani S, Delbaere A, Englert Y. Orthotopic and heterotopic ovarian tissue transplantation. Hum Reprod Update 2009; 15:649–65.

  • 14. Dolmans MM, Michaux N, Camboni A, Martinez-Madrid B, Van Langendonckt A, Nottola SA, Donnez J. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Hum Reprod 2006;21:413-20.

La radiothérapie adaptative dans les tumeurs cervico-faciales

Pierre Castadot 1, John A. Lee 1, Xavier Geets 1,2, Benoît Macq 3, Vincent Grégoire 1,2

 

1 Laboratoire d’Imagerie Moléculaire et de Radiothérapie Expérimentale, Université catholique de Louvain

2 Service de Radiothérapie-Oncologie, Centre du Cancer, Cliniques universitaires Saint-Luc

3 Laboratoire de Télécommunications et Télédétection, Université catholique de Louvain

 

De la troisième dimension...

 

La radiothérapie forme avec la chirurgie et l’oncologie médicale le trépied essentiel au traitement curatif des patients atteints de cancer. Depuis une dizaine d’années, le service de radiothérapie oncologique des Cliniques universitaires Saint-Luc associé au laboratoire d’imagerie moléculaire et de radiothérapie expérimentale de l’Université Catholique de Louvain est à la pointe de la radiothérapie tridimensionnelle en modulation d’intensité (Intensity Modulated Radiation Therapy ou IMRT en Anglais) et les tumeurs de la sphère cervico-maxillo-faciales (ORL) ont été choisies comme modèle. Cette technique de traitement des tumeurs nécessite d’abord la délimitation précise des volumes tumoraux et des organes à épargner. Pour ce faire, le radiothérapeute utilise l’imagerie anatomique comme le CT scanner ou la résonance magnétique nucléaire. En complétant les informations recueillies par de l’imagerie fonctionnelle comme la tomographie par émission de positrons (PET scan), le radiothérapeute gagne en précision dans cette étape très importante de la délimitation des volumes à traiter ou à épargner. Notre service s’est toujours montré à la pointe de l’utilisation après stricte validation de ces techniques d’imagerie innovantes.

Après avoir délimité les volumes cible et à risque, commence l’étape de la planification du traitement. Cette étape en étroite collaboration avec le service de physique consiste à adapter le traitement à chaque patient et à sa pathologie. En 2004, le service de radiothérapie a fait l’acquisition d’une machine de traitement d’une grande précision, le Hi-Art de Tomotherapy. Cette machine de traitement permet de littéralement disséquer la tumeur, car les gradients de dose générés sont très importants. Cela offre l’opportunité d’augmenter la dose de rayons délivrée au niveau de la tumeur tout en diminuant la dose au niveau des tissus sains. Ce faisant, la probabilité d’augmenter le contrôle tumoral, et donc de guérison, augmente alors que la probabilité d’effets secondaires négatifs pour le patient diminue drastiquement.

 

…À la quatrième dimension

 

Cette méthode classique de traitement des patients traités par radiothérapie souffre néanmoins d’une limitation essentielle. En ne faisant qu’un scanner de dosimétrie avant le début de la radiothérapie, les radiothérapeutes font l’hypothèse extrêmement simplificatrice que l’anatomie du patient ne change pas en cours de traitement. En réalité des phénomènes tels que la fonte tumorale, la perte de poids induite par la chimio et/ou la radiothérapie et l’œdème provoquent des modifications anatomiques très importantes. Le scanner de dosimétrie effectué préalablement à la radiothérapie ne constitue donc qu’un « cliché instantané » de l’anatomie du patient (voir Figure 1). Par exemple, notre laboratoire a pu prouver que le volume tumoral diminue de 3.2 % par jour de traitement. Par ailleurs, les glandes salivaires (parotides et sous-maxillaires) diminuent d’environ 1.2 % par jour de traitement. De plus, ces différents organes présentent de légères modifications de position (de l’ordre de 2mm), probablement dues aux phénomènes de rétraction tumorale et de perte de poids du patient. Ces modifications anatomiques induites par la radiothérapie font que la dosimétrie effectuée préalablement n’est plus tout à fait correcte vu que le traitement planifié a été appliqué sur une anatomie légèrement différente. En appliquant le traitement planifié avant le traitement sur les scanners acquis durant le traitement, nous avons évalué l’impact dosimétrique des modifications anatomiques. Ainsi, nous avons pu démontrer que tous les organes à risque (glandes parotides et sous-maxillaires, cavité orale, moelle épinière, peau) que nous souhaitons épargner en cours de traitement reçoivent systématiquement légèrement plus de doses que prévu.

Cette constatation importante nous a donc amenés à tester l’hypothèse suivante : si l’anatomie du patient varie en cours de traitement, pourquoi ne pas adapter le traitement au cours du temps à ces modifications anatomiques. Cette nouvelle manière de traiter les patients incorporant la quatrième dimension (le temps) au traitement du patient porte le nom de radiothérapie adaptative (Adaptive radiotherapy en anglais). L’hypothèse sous-jacente est qu’en adaptant le traitement aux modifications anatomiques particulières de chaque patient nous augmenterons encore la probabilité de contrôler la tumeur tout en diminuant les effets secondaires induits par notre traitement. Afin de tester cette hypothèse, nous avons utilisé des données relatives à dix patients ayant bénéficié de quatre imageries en cours de traitement. Nous avons complètement replanifié ces patients sur base des scanners acquis durant le traitement (voir Figure 2). Ce faisant, nous tenons entièrement compte des modifications anatomiques de chaque patient. En utilisant une telle méthodologie, nous sommes arrivés à la conclusion qu’en utilisant la radiothérapie adaptative, nous améliorons sensiblement la dosimétrie cumulée au niveau des organes à risque, notamment au niveau de la moelle épinière, de la cavité orale et des glandes sous-maxillaires.

Ces résultats préliminaires ouvrent la voie vers de nouvelles investigations, nous permettant d’envisager des études cliniques afin de valider les gains potentiels révélés par nos travaux.

Afin de pouvoir faire le lien entre les différents scanners et les différentes dosimétries effectuées en cours de traitement, nous avons dû développer de nouveaux outils. Ces outils, appelés algorithmes de recalage élastique, nous permettent d’identifier et de mesurer précisément les modifications anatomiques du patient. Ces outils ont fait l’objet d’une collaboration étroite avec le laboratoire de Télécommunication (Laboratoire TELE, Benoît Macq) de Louvain-la-Neuve. Ce faisant, nous avons pu adapter et choisir le meilleur programme pour les patients souffrants d’une néoplasie de la sphère cervico-faciale. Cette collaboration entre laboratoires fut extrêmement fructueuse.

 

De nouveaux projets à venir

 

Outre la possibilité de générer des gradients de dose importants, le Hi-Art de Tomotherapy offre la possibilité d’effectuer une imagerie quotidienne grâce au scanner embarqué sur cette machine de traitement. En utilisant l’information quotidienne du scanner, nous pourrons déterminer comment la dose de rayons s’est déposée à chaque séance de traitement. Cela ajoutera un gain en termes de précision par rapport aux travaux déjà effectués dans notre laboratoire.

En ce qui concerne le PET scan, le concept de radiothérapie adaptative sera étendu à l’utilisation à plusieurs traceurs. En complément du fluoro-déoxy-glucose, qui révèle l’hypermétabolisme glucidique de la tumeur, d’autres molécules indicatrices de la prolifération ou de l’hypoxie tumorale seront utilisées. Ces traceurs alternatifs seront étudiés sur une petite série de 10 patients avec tumeurs de stade avancé dans la sphère ORL. Les patients bénéficieront d’une imagerie anatomique par CT et d’une imagerie fonctionnelle par PET avec les différents traceurs à la fois avant et au cours des 3 premières semaines du traitement par radiothérapie. En utilisant les informations collectées, nous pourrons administrer une dose non uniforme au niveau de la tumeur, en visant en particulier les zones détectées comme étant radiorésistantes.

 

Les auto-anticorps : une réponse biologique peu efficace face au cancer, mais des biomarqueurs à haut potentiel.

Olivier FERON, Florence DEFRESNE et Marie GRANDJEAN

 

Laboratoire « Angiogenèse et Cancer », Pôle de Pharmacologie et de Thérapeutique, Institut de Recherche Expérimentale et Clinique, Université Catholique de Louvain

 

olivier.feron@uclouvain.be

 

Le succès des thérapies anticancéreuses est très largement lié à la précocité de la détection de la maladie. Des biomarqueurs du cancer peuvent dès lors augmenter les chances de survie en permettant de commencer le plus tôt possible le traitement le plus pertinent. Les biomarqueurs sont également susceptibles d’être exploités pour affiner le diagnostic ou lorsque la maladie est déjà avancée, comme facteurs pronostics (anticipation de l’évolution de la maladie en dehors de tout traitement) et/ou prédictifs (anticipation de la réponse aux traitements). Parmi les biomarqueurs sériques utilisés aujourd’hui, on peut citer le PSA (prostate-specific antigen) pour le cancer de la prostate, mais également le CEA (carcinoembryonic antigen) pour le cancer du côlon et les CA15-3, 19-9 et -125 respectivement pour les cancers du sein, gastro-intestinaux et ovariens. Chacun de ces tests est toutefois entaché de problèmes de sensibilité et de spécificité, et de nouveaux biomarqueurs plus fiables sont avidement recherchés (1).

 

L’identification de biomarqueurs sanguins se heurte à un obstacle de taille : les concentrations de protéines sériques varient sur une échelle de 10 ordres logarithmiques (2). En fait, 99 % de la masse des protéines sériques sont représentés par une vingtaine de protéines (3). Les biomarqueurs étant par définition parmi les protéines les moins exprimées, la sensibilité des tests de détection est aujourd’hui la limitation essentielle à un criblage à grande échelle des plasmas et sera récoltés auprès des patients. Le développement des techniques de fractionnement du sérum reflète ce besoin d’amélioration. Une technique très en vogue actuellement est basée sur l’immunodéplétion des protéines les plus abondantes pour « simplifier » le protéome sérique tout en maintenant un débit raisonnable des échantillons (4). La plupart des études publiées ne relatent toutefois qu’une réduction d’un facteur 100 des protéines abondantes, qui restent donc en quantité largement supérieure à de nombreux marqueurs potentiels. Un autre écueil de cette technique est l’élimination des biomarqueurs complexés avec ces protéines. D’autres approches prennent délibérément le parti de ne s’intéresser qu’à certaines protéines dont la nature justifie les chances d’identifier un biomarqueur du cancer. La recherche des protéines glycosylées est un exemple de protéines qui peuvent aisément être isolées du sérum et qui ont été identifiées comme jouant un rôle majeur dans la progression tumorale.

 

Dans notre laboratoire, nous avons privilégié une autre option, celle de travailler sur les auto-anticorps (aAc) dirigés contre des antigènes associés aux tumeurs (tAg) (5). Il s’agit, en fait, d’exploiter la réponse immunitaire humorale vis-à-vis des tAg reconnus comme du « non-soi » par le système immunitaire. Cette recherche s’inspire des travaux réalisés dans le cadre des maladies auto-immunes où l’identification des aAc permet, en caractérisant les Ag contre lesquels ils sont dirigés, d’élucider les mécanismes pathogéniques de la maladie.

 

L’immunité humorale est la forme d’immunité adaptative assurée par les anticorps. Ceux-ci sont produits après activation des lymphocytes B naïfs par les antigènes. Il s’en suit une expansion clonale, à savoir la prolifération des cellules spécifiques de l’antigène ainsi que leur différenciation en plasmocytes ou cellules effectrices capables de sécréter activement les anticorps. On rapporte généralement qu’un lymphocyte B naïf peut générer jusqu’à 4000 plasmocytes qui peuvent produire près de 1012 anticorps par jour ! Cette prolifération rapide trouve probablement son explication dans la nécessité de juguler les infections microbiennes. Le besoin de combattre différents types de microbes ou des microbes à différents stades de l’infection justifierait également le processus de commutation isotypique, c.-à-d. la production d’anticorps présentant différentes classes de chaînes lourdes. Les lymphocytes B qui expriment des IgM et des IgD à leur surface se mettent ainsi à produire – après stimulation par des lymphocytes T auxiliaires- des IgG (surtout IgG1 et IgG3). Dans le contexte du cancer, ce sont ces IgG qui constituent des marqueurs potentiels.

 

L’avantage des aAc par rapport aux autres protéines sériques est leur grande stabilité, leur évidente spécificité et leur détectabilité aisée à l’aide d’anticorps secondaires validés. Dans le cancer, les aAc sont dirigés contre des protéines mutées, surexprimées ou présentant une conformation incorrecte (« misfolded ») ou encore une localisation subcellulaire inadéquate (6). La protéine p53 est probablement un des tAg les plus étudiés : la détection d’aAc sérique anti-p53 est fortement corrélée avec le cancer, mais seule une faible proportion de cancers (avec p53 muté) donne lieu à la production d’aAc. D’autres aAc plus prometteurs ont été identifiés, mais attendent toujours validation : ils sont généralement dirigés contre des antigènes correspondant à des anomalies phénotypiques tumorales apparaissant précocement dans le développement des cancers sporadiques.

 

Les méthodes de détection des aAc et des tAg correspondants se sont raffinées ces dernières années avec le développement de la protéomique. Au laboratoire « Angiogenèse et Cancer », l’utilisation de la technique dénommée SERPA (serological proteome analysis) a été validée au cours des deux dernières années. En pratique, cette technique associe la séparation des protéines tumorales par électrophorèse bidimensionnelle (Figure 1), leur transfert sur une membrane et l’hybridation en présence de sera de patients atteints d’un cancer. Les auto-anticorps présents dans les sera se fixent aux antigènes qu’ils reconnaissent et le profil d’hybridation est comparé à celui obtenu à l’aide de sera de volontaires sains ou de patients présentant des formes non malignes de la maladie (Figure 2). Un résultat positif est une protéine (un antigène) reconnue par le sérum des patients cancéreux, mais pas par le sérum des « contrôles ».  Les coordonnées des « spots » protéiques reconnus sur les gels 2D analytiques sont enregistrées et permettent de les relocaliser sur des gels préparatifs chargés avec suffisamment de matériel que pour permettre une identification par spectrométrie de masse (Figure 3).

 

L’intérêt d’une technique utilisant l’électrophorèse bidimensionnelle pour séparer des extraits tumoraux est double : elle permet en effet (i) d’optimaliser la séparation des protéines et donc l’identification de l’antigène d’intérêt (un spot correspondant à une protéine) et (ii) de maintenir les modifications post-traductionnelles et donc la nature des épitopes tels que rencontrés in vivo. D’autres techniques exploitant par exemple la capacité de phages à exprimer des banques de peptides (et donc une grande diversité d’épitopes) n’intègrent pas ce type de modifications. Mieux encore, avec la technique SERPA, il est possible de reproduire in vitro les conditions du microenvironnement tumoral (hypoxie, acidité, nécrose…) qui caractérisent le cancer in vivo et par là d’encore raffiner le substrat des hybridations. Une des limitations de l’approche SERPA est toutefois le besoin de développer un test secondaire de type ELISA pour le criblage à grande échelle des sera et la validation des biomarqueurs (initialement identifiées sur de petites séries de sera).

 

Au laboratoire, la méthode SERPA a été validée chez la souris (7) et commence à être exploitée chez l’homme. L’étude chez la souris a permis d’optimiser la technologie en exploitant « le multiplexing » rendant ainsi possible la co-registration des images des profils protéomiques et des spots « allumés » par les sera des patients. Cette étude chez l’animal (porteur de tumeur) a également permis d’établir les conséquences de la radio- ou de la chimiothérapie sur le titre d’auto-anticorps. Nous avons en effet pu montrer que la toxicité systémique de nombreuses chimiothérapies réduit le nombre de plasmocytes et donc la concentration d’auto-anticorps. À l’inverse, l’irradiation locale de la tumeur stimule l’expression/l’exposition de nombreux antigènes tumoraux, et entraîne une augmentation du titre de certains auto-anticorps. Ces informations sont critiques pour interpréter correctement les études cliniques exploitant la présence de certains auto-anticorps comme marqueurs de la progression du cancer. Il faut toutefois noter que dans la même étude chez la souris, nous avons pu démontrer l’intérêt de certains auto-anticorps pour anticiper la progression angiogénique et métastatique de la maladie.

 

Plus récemment, nous avons entrepris deux études cliniques chez des patients atteints de cancer colo-rectal ou d’hépatocarcinome. Un cancer colorectal détecté précocement offre une perspective de survie à 5 ans d’environ 90 %, une détection tardive fait chuter ce chiffre à moins de 10 %. La colonoscopie a certes permis de réduire l’incidence de la maladie, mais le caractère invasif du test limite son recours systématique dans la population. Le coût d’autres techniques (tomographie et résonance magnétique) ou la faible sensibilité de tests basés sur l’analyse des selles plaident également pour le développement de nouveaux marqueurs, d’autant que les stades précoces de la maladie (polypes) répondent favorablement aux traitements chirurgicaux. Quant à l’hépatocarcinome, il dérive très souvent d’une hépatite chronique ou d’une cirrhose ; la période d’incubation peut s’étendre sur plus de 20 ans. Le suivi régulier des patients pendant cette période représente une opportunité unique de détecter l’apparition d’un marqueur précoce du cancer et, le cas échéant, de rapidement mettre en œuvre un traitement approprié.

 

En conclusion, la nature des auto-anticorps et la bonne connaissance des mécanismes biologiques qui président à et régulent leur production justifient l’intérêt qu’ils suscitent aujourd’hui comme signature précoce du cancer et de la réponse aux traitements. La validation et l’optimisation de la technique SERPA dans notre laboratoire permettent d’envisager des collaborations avec les services cliniques d’oncologie pour l’identification de biomarqueurs à visée diagnostique, mais également prédictive et pronostique.

 

Références :

 

[1] Petricoin EF, Belluco C, Araujo RP, & Liotta LA (2006) The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat. Rev. Cancer, 6, 961-967.

[2] Anderson NL & Anderson NG (2002) The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell Proteomics., 1, 845-867.

[3] Veenstra TD, Conrads TP, Hood BL, Avellino AM, Ellenbogen RG, & Morrison RS (2005) Biomarkers: mining the biofluid proteome. Mol. Cell Proteomics., 4, 409-418.

[4] Guerrier L, Righetti PG, & Boschetti E (2008) Reduction of dynamic protein concentration range of biological extracts for the discovery of low-abundance proteins by means of hexapeptide ligand library. Nat. Protoc., 3, 883-890.

[5] Tan EM & Zhang J (2008) Autoantibodies to tumor-associated antigens: reporters from the immune system. Immunol. Rev., 222, 328-340.

[6] Imafuku Y, Omenn GS, & Hanash S (2004) Proteomics approaches to identify tumor antigen directed autoantibodies as cancer biomarkers. Dis. Markers, 20, 149-153.

[7] Defresne F, Bouzin C, Guilbaud C, Michiels C, Dieu M, Raes M, & Feron O (2010) Differential influence of anticancer treatments and angiogenesis on the seric titer of auto-antibody used as tumor and metastases biomarker. Proteomics., in press.

Imagerie expérimentale par résonance magnétique du micro-environnement tumoral : opportunités pour les traitements anticancéreux

Bernard Gallez et Bénédicte Jordan

Laboratoire de Résonance Magnétique Biomédicale, Louvain Drug Research Institute, Université catholique de Louvain,

 

Bernard.Gallez@uclouvain.be

 

L’hypoxie tumorale est connue de longue date pour être un facteur clef de la croissance tumorale et de la réponse thérapeutique. L’hypoxie tumorale résulte d’une balance inadaptée entre l’apport en oxygène et sa consommation locale. D’une part, l’apport en oxygène au sein d’une tumeur est moins efficace qu’au sein d’un tissu normal étant donné les anomalies structurelles de la vascularisation tumorale. D'autre part, le métabolisme intense des cellules tumorales contribue également à la présence de régions hypoxiques dans la tumeur. Généralement, on distingue deux types d’hypoxie tumorale, appelés respectivement hypoxie chronique (persistante dans le temps) et hypoxie aiguë (fluctuante dans le temps). L’hypoxie chronique provient de la diffusion limitée de l’oxygène à distance du réseau vasculaire. L’hypoxie aiguë provient de fluctuations spontanées de flux de globules rouges dans l’arbre vasculaire tumoral. Ce dernier phénomène explique, que même dans un territoire tumoral vascularisé, on peut retrouver des zones temporairement hypoxiques.

 

L’intérêt pour l’étude de l’hypoxie tumorale provient des évidences expérimentales et cliniques suivantes. Il a été démontré que la fraction hypoxique de tumeurs solides était à l’origine d’un mauvais facteur pronostique pour les tumeurs. En effet, elle est directement impliquée dans la dissémination de métastases. Ceci se fait via des phénomènes complexes où une faible pression en oxygène va être corrélée à une surexpression de certains facteurs comme le VEGF qui sera directement impliqué dans cette cascade métastatique. Par ailleurs, l’hypoxie tumorale constitue une pression physiologique pour la sélection de cellules malignes, par exemple, par la perte de leur potentiel apoptotique (capacité à mourir spontanément de manière programmée). L’hypoxie est également à l’origine de la promotion des phénomènes angiogéniques, à nouveau avec un rôle central du VEGF. Enfin, l’expression de nombreux gènes se trouve modifiée, en particulier suite à l’induction de facteurs transcriptionnels comme HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor-1).

 

À côté de la pression que constitue l’hypoxie pour la sélection de phénotypes malins, leur croissance et leur expansion, l’hypoxie est également un facteur clef de la résistance aux thérapies anticancéreuses. En particulier, on sait que de faibles pressions en oxygène (inférieures à 5-10 mm Hg) sont responsables de résistance aux traitements par radiothérapie. On considère généralement que les cellules en hypoxie sont environ trois fois plus résistantes que des cellules normalement oxygénées. Dans une série d’expériences invasives conduites sur des tumeurs humaines avec des électrodes polarographiques, il a pu être démontré que cette mesure de pO2 constituait un facteur prédictif de la réponse à ce type de thérapie. Il semble que l’hypoxie module également la réponse d’autres traitements par agents cytotoxiques.

 

Le développement de mesures précises de l’oxygénation et de la perfusion tumorales pourrait avoir des conséquences importantes en thérapie anticancéreuse. Comprendre les déterminants de l’hypoxie tumorale pourrait mener à la découverte de nouveaux moyens diagnostiques et l’identification de nouveaux marqueurs de la progression maligne, et ainsi l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Des outils qui permettraient de mesurer l’oxygénation et la perfusion tumorales pourraient ainsi trouver de larges applications en oncologie clinique de manière à guider au mieux les traitements sur une base individuelle.

 

Ce constat est la raison d’être des recherches menées par le laboratoire de résonance magnétique biomédicale de l’UCL. Celui-ci mène des recherches précliniques visant au développement de nouvelles technologies non invasives permettant d’apprécier tous les facteurs caractéristiques de l’hypoxie tumorale : oxygénation tumorale, perfusion, perméabilité des vaisseaux, consommation en oxygène… Bien que fondamentaux en oncologie, ce n’est que très récemment que des technologies innovantes ont pu être développées au sein du laboratoire pour rendre ces paramètres quantifiables in vivo. Applicables dans des modèles de tumeurs expérimentales, ces techniques font appel à des protocoles particuliers d’imagerie de résonance magnétique nucléaire à très haut champ (détectant certains noyaux comme le proton, le fluor…) ou de techniques particulières de résonance magnétique sensibles aux électrons célibataires (comme ceux trouvés dans l’oxygène moléculaire ou dans certains radicaux libres).

 

Grâce aux outils développés au sein du laboratoire décrits plus hauts, nous avons pu nous adresser à des questions non résolues jusqu’ici en oncologie. Nous avons étudié l’influence de facteurs physiologiques ou pharmacologiques qui sont susceptibles de modifier l’hémodynamique tumorale : bilan en oxygène, étude des parts respectives de la perfusion, de la perméabilité des vaisseaux tumoraux et de la consommation en oxygène par les cellules tumorales. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence le rôle de certains statuts physiologiques ou hormonaux (par exemple, liés au statut hyperthyroïdien) sur ces paramètres physiologiques et la réponse aux thérapies anticancéreuses. La relevance en thérapie des modifications du micro-environnement tumoral induites par des traitements médicamenteux a été évaluée par l’utilisation de schémas de radiothérapie et de chimiothérapie. Ainsi, l’étude systématique des modifications hémodynamiques tumorales induites par certains composés agissant sur le tonus vasculaire, la consommation en oxygène cellulaire ou des thérapies antiangiogéniques a abouti à la définition de nouveaux schémas rationnels de thérapies anticancéreuses. Tous ces travaux sont menés en collaboration avec le laboratoire de Pharmacothérapie de l’UCL et les radiothérapeutes des cliniques universitaires Saint Luc.

 

En conclusion, les travaux consacrés à la caractérisation du micro-environnement tumoral sont actuellement poursuivis de manière intensive de par le monde. Le caractère non invasif des outils se justifie amplement par le désir d’une transposition clinique rapide et non traumatisante pour le patient. Par ailleurs, c’est la seule manière de pouvoir envisager des études séquentielles et répétées pour objectiver l’évolution dynamique et spatiale des tumeurs solides en vue de pouvoir proposer la meilleure stratégie de traitement, ou leur combinaison. Le développement d’outils tels que développés au sein du laboratoire constitue certainement un atout considérable en vue de l’individualisation du traitement sur base d’un monitoring individuel.

L’importance du glutamate dans la croissance des tumeurs cérébrales.

Pr Emmanuel Hermans, Pr Nicolas Vanhoutte

Groupe de Neuropharmacologie, Institute of Neurosciences, Université Catholique de Louvain.

 

Emmanuel.Hermans@uclouvain.be

 

Les tumeurs cérébrales sont avant tout d’origine gliale

 

Chaque année, un millier de tumeurs cérébrales sont diagnostiquées en Belgique, et dans plus de la moitié des cas, l’issue sera fatale. Dès la naissance d’un individu, les neurones ne se multiplient plus, ou de manière quasi anecdotique. Ainsi, dans la quasi-totalité des cas, les tumeurs cérébrales chez l’adulte ne dérivent pas des neurones eux-mêmes, mais plutôt d’autres cellules du tissu nerveux : les cellules de la glie ou des constituants des méninges. Cette glie, composée d’astrocytes, de cellules microgliales et d’oligodendrocytes assure un rôle de soutien physique et métabolique des neurones et est indispensable au bon fonctionnement des neurones. Les tumeurs gliales représentent près de 80 % des tumeurs malignes du système nerveux central. Ces gliomes sont responsables de dommages cérébraux graves à cause des perturbations biochimiques qu’elles entraînent, mais aussi et surtout à cause de leur croissance qui mène à la compression du tissu nerveux dans un espace non extensible que délimite le crâne. De nombreux travaux expérimentaux ont en outre démontré que les gliomes sont capables de détruire le tissu nerveux sain, et l’acide aminé glutamate pourrait jouer un rôle déterminant dans cette toxicité.

 

Les deux visages du glutamate

 

L’acide aminé L-glutamate est un neurotransmetteur majeur du système nerveux central des mammifères. Il intervient dans la transmission synaptique de la plupart des influx excitateurs et est indispensable dans des processus complexes tels la mémorisation, l’apprentissage et la plasticité neuronale. Cependant, étant donné son caractère excitateur, le glutamate constitue également une puissante toxine nerveuse si sa concentration synaptique n’est pas finement contrôlée. Ainsi, une hyperactivité glutaminergique conduit à la mort neuronale et l’hypothèse d’une « excitotoxicité » glutamatergique est souvent proposée pour plusieurs maladies neurodégénératives. Le contrôle de la concentration en glutamate dans les synapses est assuré par les astrocytes qui éliminent le glutamate extracellulaire par le jeu de transporteurs membranaires spécifiques. Les dysfonctionnements de ce système de capture sont responsables de lésions neuronales graves et la suppression génétique de ces transporteurs dans des modèles d’animaux transgéniques conduit à des crises d’épilepsie et au développement accéléré de dommages cérébraux.

Plusieurs lignées de cellules gliales tumorales sont utilisées dans les laboratoires et une découverte remarquable fut de démontrer que toutes ces lignées montrent des déficiences d’expression ou d’activité des transporteurs du glutamate. De même, les biopsies de tumeurs chez des patients ont également révélé un dysfonctionnement des systèmes de capture du glutamate dans ces cellules. Plus surprenant encore, outre le fait qu’elles n’assurent pas l’élimination du glutamate de leur environnement, elles montrent une tendance à libérer du glutamate et à renforcer une toxicité potentielle vis-à-vis des neurones.

 

Tamponner le glutamate pour freiner la croissance tumorale

 

Au cours de sa thèse de doctorat, Nicolas Vanhoutte a conforté cette hypothèse glutamatergique de la progression des tumeurs gliales. Ainsi, l’objectif de ce travail fut de modifier génétiquement une lignée de cellules gliale tumorale (lignée de cellule C6, un gliome de rat) afin d’y restaurer l’expression et l’activité du transporteur du glutamate GLT-1 (pour « glutamate transporter 1 »). À l’instar des autres gliomes, ces cellules ont une défaillance de capture du glutamate. En outre, l’exposition de ces cellules au glutamate entraîne une augmentation de leur prolifération. Le glutamate extracellulaire contribuerait ainsi à la toxicité neuronale aux abords de la tumeur et à la prolifération des cellules cancéreuses. Au travers d’une approche moléculaire élégante, c’est un modèle inductible qui a été généré. Ainsi, l’expression du gène introduit dans les cellules est artificiellement conditionnée par la présence d’un inducteur chimique spécifique, la doxycycline. En l’absence de doxycycline, le transgène est silencieux tandis que l’exposition des cellules à la doxycycline active l’expression.

Une première partie du travail a consisté en une caractérisation des cellules C6 portant ce gène du GLT-1 inductible. Diverses approches biochimiques ont permis de valider l’expression inductible du transporteur GLT-1 après exposition à la doxycycline. Après induction, la capacité de capture du glutamate par ces cellules augmente sensiblement pour se rapprocher des valeurs détectées dans des astrocytes sains. Lorsque ces cellules sont exposées à une concentration importante en glutamate, elles sont capables de l’éliminer (Figure 1). En outre, cette élimination du glutamate de leur environnement prévient l’effet prolifératif observé avec les cellules non induites. Ainsi, en présence de glutamate, la vitesse de division des cellules C6 s’accroît et cet effet est prévenu lorsque les cellules sont capables de contrôler la concentration de glutamate de leur milieu.

Ces cellules ont ensuite été utilisées dans des expériences de greffes dans le système nerveux central du rat. Ainsi, l’injection intracérébrale par stéréotaxie de 50.000 cellules C6 dans le striatum du rat entraîne la formation d’une tumeur clairement identifiable en imagerie par résonance magnétique. Au bout de quelques semaines, la tumeur remplit la quasi-totalité d’un hémisphère cérébral et l’animal succombe environ 35-40 jours après la greffe. Une série de rats greffés a été traitée avec de la doxycycline, simplement additionnée à l’eau de boisson et d’autres animaux ont été maintenus sans traitement (contrôle). La doxycycline est bien résorbée par voie orale et pénètre facilement la barrière hématoencéphalique. L’administration de doxycycline a été initiée 7 jours après greffe afin de permettre aux cellules injectées de former une tumeur avant de rencontrer l’inducteur. Certains animaux ont été sacrifiés après quelques jours et des expériences de biochimie et d’immunodétection ont révélé l’induction de l’expression du transporteur du glutamate GLT-1 au sein des tumeurs, en accord avec la caractérisation préalable des cellules in vitro. Les expériences d’imagerie cérébrale ont indiqué que la croissance de la tumeur chez les rats traités était significativement ralentie (Figure 2). D’ailleurs, en suivant l’évolution clinique des animaux, nous avons pu montrer que l’espérance de vie des rats traités à la doxycycline était rallongée d’une dizaine de jours (Figure 3).

Ces résultats démontrent donc que la restitution d’une capacité de capture du glutamate dans les cellules de gliomes ralentit la croissance de la tumeur et prolonge la survie. Plusieurs contrôles ont été réalisés afin de confirmer que l’effet bénéfique n’était pas lié à d’autres propriétés de la doxycycline administrée aux animaux. Comme précisé préalablement, l’effet bénéfique résultant de l’élimination accrue du glutamate aux abords de la tumeur provient vraisemblablement d’une diminution de la toxicité vis-à-vis des neurones. Néanmoins, la diminution de l’effet prolifératif du glutamate sur les cellules tumorales pourrait également intervenir. Cette hypothèse a été examinée en injectant les cellules C6 en périphérie, dans la patte de l’animal. Comme l’illustre la Figure 4, la tumeur se développe également en périphérie, de manière très importante puisqu’elle ne rencontre pas la barrière physique constituée par le crâne. Comme dans les tumeurs cérébrales, l’administration de doxycycline chez le rat greffé se traduit par une diminution de la croissance tumorale.

 

De la physiopathologie aux perspectives thérapeutiques.

 

L’ensemble de ces données confirme l’hypothèse qu’une défaillance de capture du glutamate est un élément important dans la croissance des tumeurs gliales et de la toxicité neuronale qui se développe aux abords de la tumeur. Manifestement, l’excitotoxicité du glutamate intervient surtout dans les étapes initiales de la maladie puisque l’effet bénéfique de notre approche est avant tout observé dans les premières semaines. Ensuite, lorsque la taille de la tumeur devient critique, la croissance n’est plus ralentie. Le modèle expérimental utilisé dans ces travaux est totalement artificiel (utilisation d’une lignée tumorale génétiquement modifiée). Les résultats obtenus avec la doxycycline ne sont bien sûr pas transposables à la clinique, mais ils permettent de démontrer l’intérêt de développer des approches thérapeutiques qui viseraient à induire l’expression de ce transporteur du glutamate afin de contrôler sa toxicité. L’implication du glutamate dans plusieurs maladies neurodégénératives suscite de nombreuses recherches quant aux processus cellulaires qui contrôlent l’expression des transporteurs du glutamate par les cellules gliales. Dans ce contexte, il a été récemment montré que certains dérivés de céphalosporines étaient capables de stimuler l’expression du transporteur GLT-1 dans les astrocytes. De tels composés pourraient trouver leur place dans l’arsenal thérapeutique des tumeurs cérébrales.

 

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